О. Л. Романова, Д. В. Сундуков, М. Л. Благонравов, Е. Х. Баринов, А. М. Голубев

Экспертная оценка патологических изменений во внутренних органах при отравлении клозапином и его комбинацией с этанолом

Монография

ebooks@prospekt.org

Информация о книге

УДК 340.67

ББК 67.5

Э41

Рецензенты:
Ерофеев С. В., доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник здравоохранения РФ, заведующий кафедрой судебной медицины и правоведения Ивановской государственной медицинской академии Минздрава России, начальник Бюро судебно-медицинской экспертизы Ивановской области;
Богомолов Д. В., доктор медицинских наук, главный научный сотрудник Российского центра судебно-медицинской экспертизы Минздрава России, главный научный сотрудник Научно-исследовательского института морфологии человека имени академика А. П. Авцына.

Под научной редакцией доктора фармацевтических наук, профессора, профессора кафедры аналитической токсикологии, фармацевтической химии и фармакогнозии Первого Московского государственного медицинского университета имени И. М. Сеченова Минздрава России, директора центра доклинических и клинических исследований ЦКП (НОЦ) РУДН Минобрнауки России В. В. Чистякова.

Монография посвящена гистоморфологическим и химико-токсикологическим изменениям во внутренних органах при острых отравлениях клозапином в эксперименте. Получены новые данные о динамике гистоморфологических изменений во внутренних органах, их зависимости от времени, прошедшего с момента изолированного введения клозапина как монопрепарата и его сочетания с алкоголем до наступления смерти. Выявлен характер распределения и условия обнаружения клозапина и его метаболитов в биологическом материале в различные сроки (3 и 24 часа) с момента отравления. Впервые показано влияние этилового спирта на характер патологических изменений во внутренних органах, вызванных токсическим эффектом клозапина.

Монография предназначена для врачей – судебно-медицинских экспертов, патологоанатомов, специалистов в области реаниматологии, патологической физиологии, ординаторов, аспирантов, научных работников, работников следствия и суда.

Печатается в авторской редакции.

Изображение на обложке с ресурса Freepik.com

УДК 340.67

ББК 67.5

© Коллектив авторов, 2022

© ООО «Проспект», 2022

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Романова Ольга Леонидовна — кандадат биологических наук, доцент кафедры нормальной физиологии ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ, ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного научного учреждения Научно-исследовательский институт морфологии человека имени академика А. П. Авцына (ФГБНУ НИИМЧ им. ак. А. П. Авцына);

Сундуков Дмитрий Вадимович — доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой судебной медицины ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ;

Благонравов Михаил Львович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей патологиии и патологической физиологии имени В. А. Фролова ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ;

Баринов Евгений Христофорович — доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры судебной медицины и медицинского права ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А. И. Евдокимова» Министерства здравоохранения РФ, профессор кафедры судебной медицины ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ, Заслуженный врач РФ, Заслуженный деятель науки и образования РАЕ;

Чистяков Виктор Владимирович — доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры аналитической токсикологии, фармацевтической химии и фармакогнозии ФГАОУ ВО «Первый Московский Государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения РФ, директор центра доклинических и клинических исследований ЦКП (НОЦ РУДН) Министерства образования и науки РФ;

Голубев Аркадий Михайлович — доктор медицинских наук, профессор, профессор кафеды судебной медицины ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ, заведующий лабораторией патологии клетки при критических состояниях Научно-исследовательского института общей реаниматологии ФГБНУ Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии (ФНКЦ РР) Министерства здравоохранения РФ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВС — внутренний стандарт

ВЭЖХ–МС/МС — высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектором

ГЖХ — газо-жидкостная хроматография

ГЖХ/МС — газо-жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектором

ГЭБ — гемато-энцефалический барьер

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт

ИВЛ — искусственная вентиляция легких

ИК-спектрометрия — спектрометрия в инфракрасной области

МНН — международное непатентованное наименование

ППР — посмертное перераспределение

ПФС — психофармакологические средства

СМЭ — судебно-медицинская экспертиза

ТСХ — хроматография в тонком слое сорбента

ЦНС — центральная нервная система

ЧСС — частота сердечных сокращений

УФ-спектрометрия — спектрометрия в ультрафиолетовой области

C — концентрация (вещества в крови)

IS — internal standard (англ. — внутренний стандарт)

HCV — Hepatitis C Virus (англ. — вирус гепатита С)

рН — power of hydrogen (англ. — водородный показатель)

Введение.
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

В настоящее время число отравлений атипичный нейролептиком клозапином остается стабильно высоким. Особенностями данных отравлений является тяжелое течение и высокая летальность, достигающая, по разным данным, 10–15% [Schulz M. et al., 2012].

Клозапин (Лепонекс, Азалептин, Клазарил, Ипрокс, Лапенакс, Лепотекс) представляет собой нейролептик с выраженным седативным эффектом. По химическому строению это трициклическое соединение, имеющее элементы сходства с производными 1,4-бензодиазепина. Фармакологическое действие клозапина многогранно и включает в себя блокаду центральных и периферических холинорецепторов, α-адренорецепторов, серотониновых и гистаминовых рецепторов, торможение высвобождения дофамина пресинаптической мембраной [Машковский М. Д., 2010]. Единого мнения о том, какой из механизмов является ведущим, на сегодняшний день не существует. Тем не менее, большинство исследователей считает наиболее значимым центральные холинолитические эффекты [Машковский М. Д., 2010; Niehues G. D. et al., 2017].

Отмечается большое число случаев применения клозапина с криминальной целью. Клофелин, длительное время использовавшийся злоумышленниками, теперь заменен клозапином. Наиболее глубокое супрессивное действие на организм характерно для сочетанного приема клозапина и этанола, что и используется в преступных целях [Слюндин Д. Г. и др., 2007].

При подозрении на отравление клозапином необходимо проведение судебно-медицинского исследования. Между тем диагностика подобных отравлений до настоящего времени затруднена в том числе по причине дефицита информации об их патогенезе. Как правило, диагностика производится комплексно и требует учета клинико-анамнестических, патологоанатомических, гистоморфологических, биохимических данных и количественного анализа содержания клозапина в биологических средах организма.

Диагностическое исследование в случаях, подозрительных на отравление клозапином, представляет собой достаточно сложную аналитическую задачу из-за необходимости изолирования небольшого количества вещества, попавшего в организм, из относительно большого объема биоматериала. Для клозапина характерен узкий терапевтический индекс (высшая суточная доза — 600 мг, смертельная — 2 г) [Видаль, 2017; Subramanian S. et al., 2017], что может послужить причиной отравлений, в том числе смертельных, даже при применении этого препарата в терапевтических целях, поэтому важная роль отводится исследованию биологических жидкостей (крови, мочи) и внутренних органов [Барсегян С. С. и др., 2012].

Известно, что клозапин кумулирует в головном мозге и легких. Тем не менее, анализ литературных источников свидетельствует о том, что исследований патогенеза изменений во внутренних органах, под воздействием клозапина, явно недостаточно. Также не проводилось систематических исследований, посвященных разработке методик изолирования, обнаружения и количественного определения клозапина в биологических объектах.

Следовательно, изучение патологических изменений во внутренних органах, вызванных клозапином, имеет высокую актуальность.

Данное исследование посвящено патологическим изменениям во внутренних органах при воздействии клозапина и его комбинации с этанолом. Ранее были изучены морфологические изменения в печени после воздействия клозапина и его комбинации с другими токсическими веществами [Зимина Л. Н., 2008], морфологические изменения в мозге при воздействии клозапина и его комбинации с этанолом [Баширова А. Р. и др., 2012].

Также проводилось изучение распределения клозапина между кровью и головным мозгом в экспериментах на крысах (метод ВЭЖХ с УФ детектированием) [Ross J et al., 1993; Lei Sun et al., 2000].

В зарубежной литературе встречаются отдельные публикации, посвященные гистоморфологическим изменениям в легких при воздействии клозапина как монопрепарата, носящие описательный характер [Arias S. A. et al., 2011; Lewis A. et al., 2012].

В ходе проведенного исследования, впервые с использованием объективных методов исследования, включающих световую микроскопию и ВЭЖХ–МС/МС, выявлен комплекс гистоморфологических и химико-токсикологических изменений во внутренних органах при острых отравлениях клозапином в эксперименте.

Получены новые данные о динамике гистоморфологических изменений во внутренних органах, их зависимость от времени, прошедшего с момента изолированного введения клозапина, и при его сочетании с этанолом до наступления смерти.

Выявлен характер распределения и условия обнаружения клозапина и его метаболитов в биологическом материале в различные сроки (3 и 24 часа) с момента отравления.

Результаты исследования показали влияние этилового спирта на характер патологических изменений во внутренних органах, вызванных токсическим эффектом клозапина.

Глава 1.
КЛОЗАПИН И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЕГО ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПРИ ОСТРЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ

1.1. Общая характеристика нейролептиков

Начало «эре нейролептиков» положил в 1950–1952 гг. синтез хлорпромазина (аминазина). Сам термин «нейролептики» (нейролептические средства) был предложен в 1967 г. Позже в ряде стран сочли уместным заменить данный термин на «антипсихотические препараты». Такое название точнее отражает основное действие препаратов этой группы [Лужников Е. А., 1992].

Нейролептики подразделяются на так называемые «типичные» и «атипичные» [Видаль, 2017; Машковский М. Д., 2010].

Нейролептическая терапия больных шизофренией классическими («типичными») нейролептиками долгое время рассматривалась в качестве стандарта, так как ее использование достоверно приводило к снижению продуктивной симптоматики у пациентов с шизофренией. Она была относительно доступной и дешевой [Asenjo Lobos C. et al., 2010].

Тем не менее, при лечении такими нейролептиками возникал ряд затруднений, связанных с резистентностью к терапии и наличием тяжелых, нередко необратимых побочных явлений, например, поздней дискинезии у пациентов. По данным литературы, она встречается в 5–45% случаев [Woggon B., 1978].

Атипичные нейролептики вошли в широкую медицинскую практику в последние десятилетия. Их появление в значительной степени расширило возможности психиатров в лечении шизофрении и других психических заболеваний.

Первым препаратом этого класса стал клозапин (Лепонекс, Азалептин, Клазарил, Ипрокс, Лапенакс, Лепотекс). Позже, в 90-е гг. XX в. в клинической практике появились и другие препараты этой группы.

Нейролептики влияют на организм многогранно. Они оказывают успокаивающее действие, снижают психомоторное возбуждение и аффективную напряженность, ослабляют чувства страха, агрессивности. Основной особенностью нейролептиков является их способность обеспечивать лечебный эффект при шизофрении и иных психических заболеваниях, включая опийную наркоманию [Essali A. et al., 2009; Видаль, 2017].

Некоторые нейролептики (алифатические производные фенотиазина, резерпин и др.) обладают седативным, некоторые (бутирофеноны и др.) — активирующим эффектом. Ряд нейролептиков (Рисперидон, Оланзапин, Флупентиксол, Сульпирид) обладает антидепрессивным действием, хотя часть из них (преимущественно с седативным компонентом) при длительном применении может вызывать специфические (заторможенные) депрессии. Такими особенностями определяется профиль действия каждого конкретного препарата и показания к его применению [Asenjo Lobos C. et al., 2010; Видаль, 2010].

Разные нейролептики оказывают различное влияние на образование, накопление, высвобождение и метаболизм нейромедиаторов, что, в значительной степени, обусловливает их фармакологические свойства и терапевтическую эффективность. Одним из основных механизмов терапевтического действия нейролептиков является их способность влиять на дофаминергические процессы, нарушение которых отмечается при различных психических заболеваниях. Влиянием на дофаминовые рецепторы обусловлен и основной побочный эффект типичных нейролептиков — экстрапирамидные расстройства [Мосолов С. Н., 2004; Kurz M. et al., 1995].

Большинство нейролептиков хорошо всасывается при разных путях введения. Они легко проникают через гематоэнцефалический барьер. Эти препараты метаболизируются в основном в печени и выделяются с мочой, частично — с фекалиями [Калетина Н. И., 2008].

1.2. Характеристика клозапина

1.2.1. Общая характеристика атипичных нейролептиков

Атипичные нейролептики отличаются от типичных рядом особенностей. Наравне с «типичными», они, связываясь с дофаминовыми рецепторами головного мозга, оказывают выраженное антипсихотическое действие, снижают психомоторную активность и уменьшают психическое возбуждение. Например, атипичные нейролептики в отличие от классических (типичных) имеют более низкую степень сродства к дофаминовым D2-рецепторам и проявляют сродство к рецепторам других типов (дофаминовые, холинорецепторы). Этим обусловлены их более «мягкие» фармакологические свойства, делающие их более легко переносимыми препаратами [Видаль, 2017].

С влиянием нейролептиков на дофаминовую систему нервных клеток головного мозга связана часть нежелательных эффектов традиционных нейролептиков, например экстрапирамидные расстройства. В отличие от типичных, атипичные нейролептики не вызывают или редко вызывают экстрапирамидные нарушения [Мосолов Н. С., 2004].

При терапии атипичными нейролептиками по сравнению с типичными ниже вероятность появления эндокринных нарушений, например, повышения пролактина (гиперпролактинемии) [Kane J. et al., 1988].

1.2.2. История создания и внедрения клозапина в клиническую практику

Синтез клозапина был впервые осуществлен в 1958 г. Опыт его клинического применения был впервые описан психиатрами Н. Grоss и E. Langner [Gross H. et al., 1966], а также D. Bente и соавт. в 1967 г. [Bente D., 1967]. Ими же было отмечено отсутствие влияния препарата на неврологическую сферу.

Позже было установлено, что данный препарат позволяет добиться терапевтического улучшения у пациентов, резистентных к типичным нейролептикам. Широко использовать клозапин в клинической практике стали в 70-е гг. XX в. Позже, в 1975 г. широкое применение клозапина (особенно в Финляндии) было ограничено вследствие описания J. Idanpaan-Heikkila и другими исследователями случаев развития агранулоцитоза при его применении [Idanpaan-Heikkila J. et al., 1975]. Позже, после анализа доступных литературных данных, препарат был возвращен на фармацевтический рынок [Kane J. et al., 1988].

1.2.3. Химическая структура, метаболизм клозапина

Клозапин (8-хлор-11-(4-метил-1-пиперазенил)-5Н-дибензо[b, e]-диазепин — это трициклическое соединение, молекулы которого также имеют сходство с производным 1,4-бензодиазепина [Видаль, 2017]. Клозапин — липофильное вещество, представляющее из себя желтый кристаллический порошок, легко растворимый в метиленхлориде, растворимый в этаноле (96%) и в разбавленной уксусной кислоте [Машковский М. В., 2010].

В составе молекулы нет заместителей с ярко выраженными гидрофильными свойствами. Химическая формула клозапина представлена на рисунке 1.

Препарат доступен в форме таблеток (12,5, 25, 50, 100 мг) и раствора для инъекций 2,5%. Клозапин метаболизируется под воздействием монооксигеназ печени. В первой фазе происходит окисление: N-окисление, дезметилирование, гидроксилирование, S-окисление [Dain J. G. et al., 1997]. Во второй фазе при конъюгации происходит присоединение эндогенных молекул, присутствующих в организме (глюкуронизация) с образованием глюкуронидов [Govard D. M. et al., 1992]. Основными метаболитами клозапина являются дезметилклозапин (норклозапин) и клозапин-N-оксид. Дезметилклозапин образуется под воздействием ферментов системы цитохрома P450 (изоформы 1A2 и 2D6 и, возможно, изоформы 3A4, 2C9, 2C19), клозапин-N-оксид — под воздействием цитохрома P450 (возможно, изоформы 3A4 и 1A2) [Zhou S. F. et al., 2009].

Рис. 1. Структурная формула клозапина (Машковский М. В., 2010)

Химические формулы норклозапина и клозапин-N-оксида представлены на рис. 2 и 3, а метаболизм клозапина на рис. 4.

Рис. 2. Структурная формула норклозапина
(Clozaril (clozapine tablets) [product monograph], 2014)

Рис. 3. Структурная формула клозапин-N-оксида
(Clozaril (clozapine tablets) [product monograph], 2014)

В головном мозге клозапин метаболизируется каталазным окислением флавинсодержащей монооксигеназой с образованием клозапин-N-оксида [Fang J. et al., 2000]. Метаболизм клозапина может происходить посредством миелопероксидазного окисления [Hsuanya Y. et al., 1999].

В ходе исследования Schaber G. et al., 1998 были идентифицированы неизвестные ранее метаболиты клозапина. Также в нескольких исследованиях было показано, что у мужчин метаболизм клозапина происходит интенсивней, чем у женщин [Kraal A. Z. et al., 2017; Castberg I. et al., 2017].

Рис. 4. Метаболизм клозапина (Clozaril
(clozapine tablets) [product monograph], 2014)

По мнению многих авторов, метаболиты клозапина обладают незначительной токсичностью [Dain J. G. et al., 1991; Karch B., 1998; Perry P. J. et al., 1991; Renwick A. C. et al., 2000], однако считается, что они могут играть важную роль в развитии побочных эффектов, в частности агранулоцитоза [Wiciński M et al., 2017; Oyewumi L. K. et al., 2002].

1.2.4. Фармакокинетические и фармакодинамические особенности клозапина

Клозапин частично всасывается в кислой среде желудка, а затем и в щелочной среде кишечника [Видаль, 2017].

Препарат активно связывается с белками (согласно различным источникам, степень связывания с белками составляет 90–97%) и имеет сродство к жировым тканям. Период полувыведения клозапина — около 10 часов: от 4,5–7,5 ч [Christians, U., 2004] до 17 ч [Видаль, 2017]. Однако эта величина подвержена значительным колебаниям [Видаль, 2017; Ackenheil М., 1989].

При острых отравлениях абсорбционная фазы клозапина может находиться в пределах 2,5–4 ч, а период полувыведения Т1/2 клозапина — в пределах 7,6–20,8 ч [Reith D. et al., 1998].

Клозапин и его метаболиты выводятся из организма почками и через пищеварительный тракт [Видаль, 2017].

Клозапин крайне редко вызывает ЭПР, сохраняя антипсихотическую активность. Однако, с повышением дозы препарата, риск их развития значительно возрастает [Машковский М. Д., 2010; Elliott E. S., 2000; Wahlbeck K. et al., 2000].

Клозапин вызывает блокаду кальциевых каналов, удлинение интервала QТ на ЭКГ и изменение ЧСС [Abdelmawla N. et al., 2006]. Удлинение интервала QT выше 500 мс повышает риск пируэт-тахикардий, которые примерно в одном из 10 случаев приводят к смерти [Ермохина Т.В., 2004].

Блокируя α-адренорецепторы, клозапин проявляет выраженный седативный эффект. Антихолинергический эффект клозапина появляется засчет конкурентной блокады М-холинорецепторов [Kervin R. W. et al., 1995].

Клозапин умерено снижает выраженность воспалительной реакции, проницаемость сосудов и уменьшает активность кининов и гиалуронидазы [Capannolo M. et al., 2015].

1.2.5. Побочные эффекты при применении клозапина

Клозапин обладает способностью оказывать ряд неблагоприятных эффектов на различные системы организма [Mohan T. et al., 2013; Winckel K. et al., 2015].

Наиболее неспецифичными побочными эффектами, вызываемыми клозапином, являются сонливость, тахикардия, головокружение, констипация, гипотензия, а потенциально фатальными — развитие агранулоцитоза [Alvir J. M. et al., 1993; Hasegawa M. et al., 1994; Indappan-Heikkila J. et al., 1975], судорог [Wu C. S. et al., 2016; Devinsky D. et al., 1991; Simpson G. M. et al., 1978], нарушения функции сердечно-сосудистой системы [Abdelmawla N. et al., 2006], печеночной недостаточности [Douros A. et al., 2015], лекарственного гепатита [Brown C. A. et al., 2013], сахарного диабета [Koller E. et al., 2001], нефрита [Chan S. Y. et al., 2015]. Показано, что у монголоидов по сравнению с европеоидами терапевтический эффект препарата наступает при значительно более низких концентрациях клозапина в крови, а побочные реакции препарата развиваются чаще [Matsuda K. T. et al., 1998].

Одним из побочных эффектов клозапина является эозинофилия [George T. P. et al., 1998; Oyewumi L. K. et al., 2002]. По сравнению с мужчинами риск развития эозинофилии у женщин значительно выше [Schaber G. et al., 1998].

Препарат дозозависимым образом снижает порог судорожной готовности. Сообщается о случаях развития миоклонических мышечных сокращений и генерализованных судорог [Wu C. S. et al., 2016].

Применение клозапина связано с повышенным риском развития венозной тромбоэмболии. В большинстве случаев она развивается в первые 3 месяца после начала терапии. В половине случаев развивается ТЭЛА [Coodin S. et al., 2000].

Клозапин обладает гепатотоксичностью, которая при этом не имеет клинических проявлений [Brown C. A. et al., 2013; Douros A. et al., 2015; Tucker P. et al., 2013; Winckel K. et al., 2015].

В ряде зарубежных источниках описываются случаи развития интерстициального нефрита и острой почечной недостаточности при применении клозапина [Chan S. Y. et al., 2015; Meeker J. E. et al., 1992].

Препарат способен вызывать острый бессимптомный панкреатит [Sautter Th. et al., 1996], нарушение толерантности к глюкозе [El-Seweidy M. M. et al., 2014; Smith G. C. et al., 2014] и сахарный диабет 2-го типа [Koller E. et al., 2001].

1.2.6. Взаимодействие клозапина с другими веществами

Чаще всего в клинической практике клозапин применяется как монопрепарат.

Его противопоказано назначать совместно с этанолсодержащими препаратами и самим этанолом ввиду повышения тяжести угнетающего его действия на ЦНС. Происходит резкое усиление его угнетающего действия в отношении дыхательного центра с резким снижением артериального давления, что может привести к серьезным последствиям вплоть до летального исхода. Эти свойства клозапина и используют при криминальных отравлениях [Слюндин Д. В. и др., 2007].

При совместном применении клозапина и бензодиазепинов наблюдается усиление угнетающего действия на ЦНС. Тем не менее в ретроспективном исследовании случаев совместного применения клозапина и бензодиазепинов (N = 152) авторы сделали вывод о возможности безопасного применения данной комбинации препаратов при условии тщательного контроля ЧСС и артериального давления [Bitter A. et al., 2008].

При совместном применении клозапина с препаратами, вызывающими артериальную гипотензию, возможно аддитивное гипотензивное действие.

Клозапин даже в виде монотерапии может оказывать токсическое действие на кроветворную систему. При совместном же применении с препаратами, вызывающими миелодепрессию, наблюдается усиление токсического действия [Clozaril (clozapine tablets) [product monograph], 2014].

При совместном применении клозапина с препаратами, характеризующимися высокой степенью связывания с белками крови (например, дигоксином, гепарином, варфарином, НПВС и т. д.), возможно его вытеснение из участков связывания с белками. Как следствие, повышается концентрация клозапина в крови, что может привести к проявлению токсических эффектов [Видаль, 2017].

Клозапин взаимодействует с кофеином. При совместном применении клозапина и кофеина наблюдается снижение метаболизма клозапина. В частности, в одном небольшом рандомизированном перекрестном исследовании (n = 12, доза кофеина 400–1000 мг) было показано снижение клиренса клозапина в группе пациентов, получавших кофеин, на 14% по сравнению с пациентами, не получавшими кофеин (P = 0,05). При приеме кофеина в течение 12 часов наблюдалось статистически значимое снижение соотношения дезметилклозапин/клозапин (–18%), клозапин — N-оксид/ клозапин (–23%) (P = 0,03 и 0,02, соответственно). Авторы сделали вывод о том, что кофеин угнетает метаболизм клозапина [Hagg S., Spigset O. et al., 2000].

В случае одновременного применения клозапина и вальпроата наблюдалось изменение концентрации клозапина в плазме крови, но клинические проявления такого взаимодействия отсутствовали [Raaska K., 2003].

Клозапин взаимодействует с антидепрессантами. В одном из зарубежных исследований изучалось влияние сертралина и пароксетина на концентрацию клозапина у пациентов с шизофреней или шизоаффективными расстройствами (n = 17, в группе, получающей сертралин в дозе 50–100 мг/день 8 пациентов; 9 пациентов в группе, получающей пароксетин в дозе 20–40 мг/день и сертралин в дозе 50–100 мг/день, доза клозапина 200–400 мг/день). После 3 недель терапии в группе пациентов, получавших сертралин и пароксетин, наблюдалось статистически значимое повышение концентрации в плазме крови клозапина (на 31%; p < 0,01) и норклозапина (на 20%; p < 0,05), концентрация клозапин-N-оксида оставалась практически неизменной. Соотношение норклозапин/клозапин оставалось неизменным. В группе пациентов, получавшех клозапин и сертралин, концентрация клозапина и его метаболитов оставалась неизменной. Авторы предположили, что пароксетин влияет на метаболизм клозапина, а соответственно и на концентрацию клозапина и его метаболитов путем угнетения фермента — цитохрома CYP2D6. В то же время подобных явлений не наблюдается при совместном приеме клозапина и сертралина, поскольку сертралин не оказывает влияния на цитохромы [Burns M. J. et al., 2001].

1.3. Острые отравления клозапином

1.3.1. Эпидемиология острых отравлений клозапином

Клозапин широко применяют в терапевтических целях как в России, так и за рубежом.

За период 1998–2001 гг. число острых отравлений этим веществом возросло в 2 раза, а летальность составила 12–18% [Ермохина Т. В., 2004]. По данным зарубежных исследований, летальность при данном заболевании составляет в среднем 10% [Schulz M. et al., 2012].

За период с 2003 по 2006 г. в г. Москве и Московской области 99,7% всех случаев криминальных отравлений составили отравления клозапином. При этом особенностью этих отравлений является наличие второго токсиканта — этанола. В то же время количество правильно диагностированных отравлений невелико. По данным Д. Г. Слюндина и соавт., в 2007 г. доля пациентов с корректно поставленным диагнозом в ГКБ № 33 им. проф. А. А. Остроумова составила 1,76%. В большинстве случаев пострадавшие от криминальных отравлений клозапином — мужчины трудоспособного возраста [Слюндин Д. Г. и др., 2004, 2007].

По данным О. И. Соколовой (2007), за период с 2003 по 2006 г. по Свердловской области возросло число случаев обнаружения клозапина при проведении судебно-химического анализа в 3,5 раза, при этом в структуре отравлений лекарственными средствами произошло увеличение доли случаев интоксикации этим препаратом в два раза с 4% в 2003 г. до 8% в 2005 г. [Соколова О. И., 2007].

В табл. 1 приводятся данные Свердловского областного бюро судебно-медицинской экспертизы по отравлениям клозапином за 2004 г. [Соколова О. И., 2007].

Таблица 1

Статистические данные Свердловского областного бюро судебно-медицинской экспертизы по отравлениям клозапином за 2004 г. [Соколова О. И., 2007]

Возраст

Кол-во
случаев

%

Пол
м/жен

%
мужчин

%
женщин

Обнаружен клозапин и этанол (%)

Обнаружен клозапин с другими веществами (%)

До 20 лет

2

11,8

2-м

0-жен

11,8

–

Из 2–2 (100%)

Из 2–1 (50%)

От 20 до 30 лет

7

41,2

7-м

0-жен

41,2

–

Из 7–3 (42,85%)

Из 7–4 (57%)

От 30 до 40 лет

2

11,8

3-м

1-жен

5,9

5,9

Из 2–0 (0%)

Из 2–2 (100%)

Старше 40 лет

6

35,9

3-м

3-жен

17,6

17,6

Из 6–2 (33,3%)

Из 6–1 (16,67%)

Всего

17

74,47

23,53

Из 17–7 (41,2%)

Из 17–8 (47%)

1.3.2. Клинические симптомы острых отравлений клозапином и патогенетические механизмы, обусловливающие их появление

Ведущими симптомами при отравлении клозапином являются психоневрологические расстройства, угнетение функции ЦНС и сердечно-сосудистой системы. В токсикогенной фазе чаще всего гибель происходит от интоксикации, а в соматогенной — от пневмонии [Богомолова И. Н. и др., 2005].

В зарубежных источниках литературы описаны случаи отравлений клозапином как у детей, так и у взрослых. Отмечено, что наибольшей чувствительностью к клозапину обладают дети, а также взрослые, ранее никогде не принимавшие этот препарат [Flanagan R. J. et al., 2003; Flanagan R. J. et al., 2005; Lang U. E. et al., 2008].

Очень незначительная корреляция между дозой клозапина, принятой пациентами, концентрацией препарата в крови и клиническими эффектами объясняется индивидуальными особенностями ферментов системы цитохрома P-450 [Fang J. et al., 2000].

У взрослых пациентов появление токсических эффектов происходит через 1–2 ч после приема клозапина, а своего максимума они достигают через 4–6 часов после введения препарата. Основные симптомы интоксикации клозапином — угнетение ЦНС, дыхательной системы, резкое снижение артериального давления, синусовая тахикардия, холинолитические эффекты. Появление ЭПР отмечали у детей, хотя содержание клозапина в сыворотке их крови не превышало среднего терапевтического уровня взрослых людей [Burns M. J. et al., 2001].

Согласно данным Д. Г. Слюндина, А. С. Ливанова и соавт. (2004) [Слюндин Д. Г. и др., 2004] клинические проявления при криминальных отравлениях клозапином при его сочетании с этиловым спиртом (при средних концентрациях препарата в моче 11,7 мкг/мл, этанола в крови и моче — 2,2%о и 3,0%о соответственно) отличаются стремительным развитием угнетения сознания и короткой длительностью токсикогенной фазы.

Главной причиной смерти пациентов в случае острого отравлениея клозапином была полиорганная недостаточность. Показано, что при пороговых концентрациях клозапина в крови симптомы отравления неярко выражены и специфичны. По мере возрастания концентрации токсиканта до критического и смертельного симптомы становятся все более неспецифичными (острая дыхательная и сердечная недостаточность, нарушение кровообращения, пневмония). Этому симптомокомплексу в морфологическом плане соответствовали отек легких, ателектазы, повреждение слизистой трахеобронхиального дерева и расстройства кровообращения во внутренних органах [Ильященко К. К. и др., 2002].

В отдельных исследованиях приводятся данные о нарушении показателей гемостаза у пациентов с отравлениями психофармакологическими средствами (изолированными и комбинированными), в том числе и клозапином [Калянова Н. А. и др., 2002; Мелентьев А. Б. и др., 1999].

Отмечается, что у пациентов с тяжелой формой отравлений ПФС отмечалось иммунодефицитное состояние, нарушение механизмов неспецифической клеточной резистентности организма. Оно выражалось резкой лимфоцитопенией крови со снижением как относительного, так и абсолютного количества Т-лимфоцитов, возрастанием числа нейтрофилов, продуцирующих активные формы кислорода, заметным снижением концентрации иммуноглобулина класса С [Ястебова Е. В. и др., 1997].

Первые часы после отравления ПФС характеризуются значительной активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Концентрация первичных и вторичных продуктов ПОЛ в крови однонаправлена и с течением времени возрастает [Калянова Н. А. и др., 2002]. В исследовании, посвященном комплексному изучению изменения состояния системы ПОЛ при тяжелых отравлениях ПФС, была показана возможность применения этих показателей для установления степени тяжести отравления и оценки эффективности проводимого лечения и возможного исхода заболевания [Глушков С. И. и др., 2003].

1.3.3. Морфологические изменения в органах при острых отравлениях клозапином

Гистоморфологические изменения во внутренних органах при отравлении клозапином неспецифичны и характеризуются, в основном, дисциркуляторными расстройствами и дистрофическими изменениями в паренхиматозных органах [Зимина Л. Н. и др., 2005, 2008].

Например, в исследовании, проведенном в НИИ им. Н. В. Склифосовского, у всех умерших от острого отравления клозапином были выявлены однотипные изменения печени, характеризующиеся очаговым или диффузным стеатозом. Жировая дистрофия носила как крупно-, так и мелкокапельный характер. У части пациентов был диагностирован гепатит (в том числе HCV-этиологии). Многие из них длительно употребляли психотропные препараты с терапевтической целью, а часть злоупотребляли алкоголем. Однако примерно в половине наблюдений мелкокапельный стеатоз печени не был обусловлен ни одной из вышеуказанных причин, поэтому его развитие могло быть обусловлено однократным употреблением токсичных доз психотропных препаратов [Зимина Л. Н. и др., 2008].

В зарубежной литературе описаны случаи появления токсического гепатита под влиянием клозапина [Brown C. A., et al., 2013; Douros A. et al., 2015; Tucker P. et al., 2013].

Описаны случаи так называемого клозапин-ассоциированного эозинофильного миокардита, что относительно специфично для отравления клозапином [Haas S. J. et al., 2007; Hӓgg S. et al., 2001; Kilian J. G. et al., 1999; Winckel K. et al., 2015, Datta T. et al., 2018, Belissima B. L. et al., 2018, Savvatis K. et al., 2018].

Согласно данным производителя клозапина, риск его развития оценивается как 1:14000, смертность при этом составляет 23% [Clozaril product monograph, 2014]. В других исследованиях риск развития миокардита оценивается в 0,015% — 0,188% (примерно 1 к 500), а в одной серии случаев риск развития миокардита оценивался как 0,7%–1,2% (приблизительно 1 к 100) [Haas S. J. et al., 2007]. При этом он наиболее высок в первые месяцы терапии, но сообщается и о случаях развития миокардита через несколько лет после начала лечения [Chatterton R. et al., 1997; Lang U. E. et al., 2008].

Отравления клозапином сопровождаются изменениями в головном мозге (уменьшение объема базальных ганглиев, уменьшение объема серого вещества в коре больших полушарий и снижение кровотока)[Garcia G. J. et al., 2015].

В одном исследовании [Elmorsy E. et al., 2014] было показано, что клозапин оказывает непосредственное действие на эндотелиальные клетки гемато-энцефалического барьера (ГЭБ) с нарушением его функции. Это связано с развитием оксидативного стресса и сопровождается конденсацией и фрагментацией хроматина в клетках эндотелия ГЭБ.

В случаях смерти от острого комбинированного отравления клозапином и этанолом, что также нередко встречается в судебно-медицинской практике, выявляются острые неспецифичные повреждения нейронов головного мозга (как обратимые, так и необратимые) и нарушения кровообращения: полнокровие сосудов микроциркуляторного русла, периваскулярный и перицеллюлярный отек, что подтверждается результатами гистологических исследований головного мозга пациентов, умерших от сочетанного отравления клозапином и этанолом (26 человек в возрасте от 22 до 63 лет) [Баширова А. Р. и др., 2013].

Морфологические изменения в легких при острых отравлениях клозапином изучены недостаточно. В зарубежной литературе встречаются лишь отдельные данные. Например, сообщается о развитии лимфоцитарного альвеолита, предположительно связанного с систематическим применением клозапина [Arias S. A. et al., 2011]. Описан случай развития интерстициальной пневмонии у пациента, работавшего в производственном отделе аптеки и контактировавшего с порошком клозапина в течение нескольких лет. Возможно, развитие пневмонии связано с ингаляционным воздействием клозапина [Lewis A. et al., 2012].

1.4. Химико-токсикологическое определение клозапина

1.4.1. Методы изолирования клозапина из биологического материала

Химико-токсикологическое исследование при подозрении на отравление клозапином представляет собой достаточно сложную аналитическую задачу, поскольку связано с изолированием относительно небольшого количество вещества из большой массы биологического материала. В доступной литературе [Карташов В. А. и др., 1990; Крамаренко В. Ф., 1962; Крамаренко В. Ф., 1989; Саломатин Е. М., 1988; Швайкова М. Д., 1975] можно найти описание как общих, так и частных методик изолирования вещества, использование которых возможно при изолировании клозапина из биоматериала при проведении химического анализа.

Общие методики изолирования

К общим методикам изолирования клозапина можно отнести метод Стаса—Отто (изолирование спиртом с щавелевой кислотой) и метод Васильевой (изолирование водой с щавелевой кислотой).

К положительным сторонам метода Стаса—Отто можно отнести его универсальность, к отрицательным — большую рекомендуемую массу навески (100 г), большую длительность анализа (7 ± 3 дней), его многостадийность [Крамаренко В. Ф., 1962].

Достоинства метода А. А. Васильевой — его экспрессность, небольшая потеря вещества при изолировании и невысокая стоимость. Отрицательные стороны метода — большая масса рекомендуемой навески (100 г), отсутствие стадии очистки, а в отдельных случаях — невысокий процент извлечения веществ [Швайкова М. Д., 1975].

Частные методы изолирования

При исследовании крови и мочи объект подкисляют раствором хлороводородной кислоты до рН = 2–3. Проводят экстракцию несколькими порциями эфира (фракция А), затем проводят подщелачивание 25% раствором гидроксида аммония до рН 9–10 и экстракцию порциями хлороформа (фракция Б). Вещества кислой, нейтральной и слабощелочной природы оказываются во фракции А, а во фракции Б — вещества основного характера [Еремин С. К. и др., 1993].

В работах [Козлов И. С. и др., 1986; Невинчаный В. И. и др., 1987] изолирование клозапина проводили с использованием дистиллированной воды, подкисленной щавелевой кислотой. При этом изолирование и из кислой, и из щелочной среды проводилось хлороформом.

В своей работе П. Ю. Лукьянчиков [Лукьянчиков П. Ю. и др., 2004] привел данные о методе изолирования клозапина водой, подкисленной хлороводородной кислотой (выход клозапина составил 11–16%).

А. Б. Мелентьев предлагает перед проведением химического анализа методом ГХ/МС провести пробоподготовку с переводом клозапина в трифторуксусное производное [Мелентьев А. Б. и др., 1999].

H. Weigmann et al. предлагают следующую методику пробоподготовки: кровь подвергается центрифугированию в течение 10 мин. при 3000g; образцы для анализа хранятся при t = –20° С; навеска мозга массой 100–200 мг подвергается гомогенизации в 4 объемах метанола, далее гомогенаты центрифугируют и полученный супернатант исследуют на предмет наличия клозапина и дезметилклозапина [Weigmann H.
et al., 1999].

1.4.2. Обнаружение клозапина методом ТСХ

«Хроматография — метод разделения веществ, в основе которого лежит разница в коэффициентах распределения этих веществ между подвижной и неподвижной фазами» [Гейс Ф., 1999; Георгиевский В. П. и др., 1989; Дегтерев Е. В. и др., 1998; Еремин С. К. и др., 1993; Кирхнер Ю. и др., 1981; Рейхарт Д. В. и др., 2005].

Методом хроматографии в тонком слое сорбента можно достаточно избирательно разделить компоненты смеси анализируемого образца. Для химического анализа имеет большое значение количество исследуемых веществ с соэкстрактивными веществами биологической матрицы, поскольку объектами исследования обычно являются сложные смеси. Чувствительность метода ТСХ составляет 100–1000 нг/мл [Жуков О. И. и др., 1998].

Из положительных сторон данной методики следует отметить ее невысокую стоимость. Для нее не требуются сложное оборудование и специальная подготовка. Методика приемлема для идентификации и очистки отдельных веществ, а также для разделения смесей веществ.

Клозапин обнаруживают на хроматограммах при помощи модифицированного реактива Драгендорфа, йодплатинатного реактива, формальдегид-серной кислоты, азотной кислоты [Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, 2004]. Предел детектирования клозапина на хроматографических пластинках «Сорбфил» составляет 0,2 мкг [Горбачева Н. А. и др., 2006].

Идентификацию клозапина, изолированного из биологического материала, на хроматограммах проводят по величине коэффициента распределения Rf, которая индивидуальна для каждого вещества [Фартушный А. Ф., 1999].

В работах приводятся различные системы подвижных фаз [Гончаренко В. А. и др., 1994; Горбачева Н. А. и др., 2006; Еремин С. К. и др., 1993; Козлов И. С. и др., 1986; НД 42-5335-99, 1999; НД 42-6620-99, 1999; Невинчаный В. И. и др., 1987; Никитин П. В., 1996; ФС 42-2803-99, 1999; Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, 2014].

Надежность результатов анализа определяется чувствительностью и специфичностью метода. Комбинируя различные варианты ТСХ, можно повысить информативность метода.

1.4.3. Обнаружение клозапина методом УФ-спектрометрии

Использование физико-химических методов (УФ- и ИК-спектрометрия) позволяет обнаружить искомое вещество, извлеченное из биологического материала [Берштейн И. Я. и др., 1986; Булатов М. И. и др., 1986; Невинчаный В. И. и др., 1987; Никитин П. В. и др., 1996; Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, 2004].

Ультрафиолетовая спектроскопия (УФ-спектроскопия) представляет собой раздел молекулярной оптической спектроскопии, изучающей спектры поглощения и отражения электромагнитного излучения в ультрафиолетовой области (от 100 до 400 нм).

Применение электронной спектроскопии в ультрафиолетовой области спектра для анализа функциональных групп ограничено тем, что соответствующие спектры имеют небольшое число полос поглощения. Преимущество метода — высокая чувствительность, что позволяет исследовать очень разбавленные растворы.

Ввиду особенностей химического строения клозапина (двойные связи, хромофоры, ауксхромы) метод УФ-спектрофотометрии пригоден для его идентификации и количественного определения при подборе оптимального растворителя и создании оптимального pH.

«УФ-спектр 0,001% раствора субстанции клозапина в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты в УФ-области от 220 до 350 нм имеет максимумы поглощения при длине волн 240 + 2 нм и 294 + 2 нм, а минимум при длине 225 ± 2 нм» [ФС 42-2803-99]. «УФ-спектр в щелочной среде имеет максимумы абсорбции при длинах волн 238, 261, 297 нм» [Toxicological Analysis, ed. R. K. Mueller, 2015].

1.4.4. Обнаружение клозапина методом ИК-спектрометрии

Инфракрасная спектроскопия (ИК-спектроскопия) представляет собой раздел молекулярной оптической спектроскопии, изучающий спектры поглощения и отражения электромагнитного излучения в инфракрасной области.

«ИК-спектр клозапина характеризуется полосами поглощения средней интенсивности при 1385–1395 см⁻¹ (дуплет с преобладанием максимума при 1390 см⁻¹, вызванный деформационными колебаниями С — Н групп), при 1465–1475 см⁻¹ (валентные колебания С — Н групп), 1610 см⁻¹ (валентные колебания ароматического цикла). Для поглощения клозапина характерны полосы малой интенсивности при 1675 см⁻¹ (валентные колебания С — N групп), 1380, 1430, 1490, 1570 см⁻¹» [Невинчаный В. И. и др., 1987].

Возможность идентификации клозапина спектральными методами после изолирования из биоматериала показана в работах И. С. Козлова, В. И. Невинчаного, П. Н. Никитина [Невинчаный В. И. и др., 1987; Никитин П. В., 1996, Козлов И. С. и др., 1986].

1.4.5. Обнаружение клозапина с применением современных физико-химических методов

Преимуществами современных физико-химических методов анализа (таких как газо-жидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография) являются экспрессность (время анализа от 15 до 30 минут), объективность полученных результатов, высокая селективность, возможность совмещать процессы качественного и количественного определения [Барсегян С. С. и др., 2012; Жуков О. И. и др., 1998; Сакодынский К. И. и др., 1989].

Для проведения исследования этими методами [Бабилев Ф. В. и др., 1987; Березкин В. Г., 2003; Царев Н. И. и др., 2000] необходимо специальное оборудование [Полякова А. А., 1983; Терентьев П. Б., 1979; Хмельницкий Р. А. и др., 1984] и специальная подготовка персонала для работы с ним. При анализе методом ГЖХ могут применяться различные детекторы: ПИД, ТИД, ДЭЗ и другие. При исследовании методом ВЭЖХ также применяются различные типы детекторов: флуориметрический, рефрактометрический, спектрометрический и др. [Букреева Л. П. и др., 2000; Жуков О. И. и др., 1998; Рейхарт Д. В. и др., 2005; Сакодынский К. И. и др., 1989].

При исследовании методом ГЖХ идентификация вещества проводится на основе параметров удерживания самого вещества, его метаболитов и продуктов, полученных в процессе его дериватизации в результате реакций этерификации, ацетилирования и т. д. ГЖХ можно успешно комбинировать с другими физико-химическими методами. Например, масс-спектрометрия в сочетании с ГЖХ (ГХ/МС) дает возможность разделять и анализировать многокомпонентные смеси [Барам Г. И. и др., 2002].

Эти методы перспективны для применения в судебной химии, поскольку подходят для определения малых количеств веществ в биожидкостях и тканях [Christians U., 2004; Zweigenbaum J. et al., 2002]. Кроме того, ГХ/МС дает возможность идентифицировать неизвестные соединения и проводить их количественное определение.

При работе со сложными биообъектами перед проведением ГХ/МС анализа требуется предварительная пробоподготовка. Кроме того, этот метод не позволяет анализировать малолетучие соединения.

Существует возможность сочетания такого метода, как высокоэффективная жидкостная хроматография, с методом масс-спектрометрии. С помощью данной методики можно анализировать труднолетучие и термолабильные вещества.

Масс-спектр клозапина характеризуется ионами m/z (приведенные в порядке уменьшения интенсивности): 243, 256, 70, 245, 192, 227, 258, 326 — молекулярный [Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, 2004].

В своей работе Н. А. Горбачева и соавторы идентифицируют клозапин и его метаболит норклозапин в эксгумированном материале по временам удерживания. При условиях, в которых проводили определение, время удерживания составило 12,71 и 13,32 минуты для клозапина и норклозаина соответственно. Клозапин-N-оксид обнаружен не был. Извлечения дериватизировали при помощи уксусного ангидрида, получая при этом ацетилированный клозапин (клозапин-АС) [Горбачева Н. А. и др., 2006].

Методики исследования с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии приводятся в нормативных документах на оригинальный препарат — лепонекс (таблетки, раствор для инъекций) [НД-5335-99, 1999; НД-42-6620-99]. В опубликованных работах, посвященных клиническому исследованию клозапина и его метаболитов в биологических жидкостях, в качестве внутреннего стандарта применяли локсапин, трипролидин, мапротилин и др. [Guitton C., 1997; Lovedahl M. J. et al., 1991; Schulz M. et al., 2012; Wilhelm D. et al., 1990; Zeren W. et al., 1986].

В другой методике определения содержания клозапина и норклозапина методом ВЭЖХ-МС (LC-MSD) в качестве внутренних стандартов применяют флюразепам и перициазин [Zweigenbaum J. et al., 2002].

Процесс разделения в жидкостной хроматографии определяется сродством компонентов смеси к неподвижной фазе и межмолекулярными взаимодействиями вещества и подвижной фазы. При проведении анализа клозапина методом ВЭЖХ предлагают применять различные варианты подвижных фаз [Лукьянчиков П. Ю., 2004; Guitton C., 1997; Zeren W. et al., 1986].

Особенностью спектрофотометрического детектора ВЭЖХ является возможность сочетания регистрации поглощения по времени удерживания пика с дополнительной идентификацией по УФ-спектру вещества. Проведение измерения при нескольких длинах волн и получение дифференциальных спектров дает возможность многоволновой детекции.

Описана методика измерения содержания клозапина и его метаболитов (норклозапина и клозапин-N-оксида) в плазме крови и мозге подопытных крыс после единократного введения клозапина методом ВЭЖХ-МС [Ross J et al., 1993]. Также проводилось изучение фармакокинетических и фармакодинамических особенностей клозапина (объект исследования — плазма) при внутривенном и пероральном введении этого препарата, оценивалось распределение клозапина и норклозапина между плазмой и мозгом крыс с применением ВЭЖХ-МС с УФ-детектированием [Lei Sun et al., 2000].

На основании вышеизложенного можно отметить, что клозапин представляет собой атипичный нейролептик, который обладает многогранным действием (антипсихотическим, седативным и миорелактирующим). Клозапин хорошо всасывается в желудочно-кишечном тракте, максимальной концентрации достигает через 2,5 часа. Препарат активно связывается с белками ткани (95%), накапливается в паренхиматозных органах (легкие, почки), имеет относительно длительный период полувыведения и выводится печенью и почками. При совместном попадании клозапина и этанола в организм наблюдается резкое возрастание угнетающего воздействия на ЦНС. Такие отравления характеризуются особо тяжелыми симптомами и высокой летальностью.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что систематических исследований, посвященных патологическим изменениям во внутренних органах при отравлении клозапином и его комбинацией с этанолом, ранее не проводилось.

Глава 2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные, введение, отбор биопроб

Вид

Крысы

Линия/пол

Беспородные/самцы

Источник

питомник РАМН, отделение Крюково

Масса тела к началу эксперимента

290–400 г

Количество животных

4 экспериментальные группы по 5 крыс; 5 крыс — группа сравнения.

Данные о массе подопытных животных представлены в табл. 2.

Таблица 2

Масса и маркировка подопытных крыс

№ п/п

Масса крысы, г

Группа

Маркировка

Маркировка биоматериала

1.

340

1

Крыса 1

1

2.

320

1

Крыса 2

2

3.

340

1

Крыса 3

3

4.

320

1

Крыса 4

4

5.

310

1

Крыса 5

5

6.

320

2

Крыса 6

6

7.

290

2

Крыса 7

7

8.

270

2

Крыса 8

8

9.

330

2

Крыса 9

9

10.

290

2

Крыса 10

10

11.

350

3

Крыса 2Э*

2 eth

12.

335

3

Крыса 3Э

3 eth

13.

325

3

Крыса 4Э

4 eth

14.

300

3

Крыса 7Э

5 eth

15.

390

3

Крыса 6Э

6 eth

16.

390

4

Крыса 7Э

7 eth

17.

375

4

Крыса 8Э

8 eth

18.

390

4

Крыса 9Э

9 eth

19.

375

4

Крыса 10Э

10 eth

20.

400

4

Крыса 11Э

11 eth

21.

400

Интактное животное

Контроль-1

Contr-1

22.

400

Интактное животное

Контроль-2

Contr-2

23.

390

Интактное животное

Контроль-3

Contr-3

24.

380

Интактное животное

Контроль-4

Contr-4

25.

380

Интактное животное

Контроль-5

Contr-5

*Э (eth) — здесь и далее обозначены животные, получавшие этанол

Выбор вида животных

Для данного исследования были выбраны крысы (самцы, возраст 20 нед.) как вид животных, рекомендованный Министерством здравоохранения РФ для токсикологических исследований.

Количество животных в одной группе, достаточное для получения статистически достоверных данных, составило 5 крыс.

Способ введения, доза

Введение перорально (через зонд) — суспензия клозапина (группы 1 и 2).

Доза = 150 мг/кг.

Введение перорально (через зонд) — суспензия с клозапином и этанолом (группы 3 и 4).

Доза клозапина 150 мг/кг;

Доза этанола 5 мл/кг.

Приготовление пероральной суспензии клозапина для экспериментов на животных

В фарфоровую ступку помещали 20 таблеток клозапина по 25 мг (500 мг суммарно), измельчали пестиком до консистенции порошка и прибавляли 10 мл физраствора, растирали пестиком по часовой стрелке в течение 1 минуты до получения гомогенной однородной кашицы. После этого, не прекращая растирания, прибавляли оставшееся количество (15 мл) физраствора. Таким образом, концентрация клозапина в полученной суспензии составляла 20 мг/мл.

Перед каждым введением животному суспензию взбалтывали на аппарате для встряхивания жидкости.

Приготовление пероральной суспензии клозапина с этанолом для экспериментов на животных

В фарфоровую ступку помещали 20 таблеток клозапина по 25 мг (500 мг суммарно) и растирали в порошок. Порциями добавляли 25 смеси из 8,3 мл физраствора и 16,7 мл этанола (чистого) до получения суспензии.

Получили: 25 мл суспензии, содержащей 500 мг клозапина, 16,7 мл этанола (96%) и 8,3 мл физраствора. Концентрация клозапина в полученной суспензии составила 20 мг/мл, этанола 70 об%.

Содержание животных

Животные содержались по 5 особей в специальных поликарбонатных клетках (площадь пола 1663 см²).

Корм

Стандартный комбикорм гранулированный полнорационный для лабораторных животных (мыши, крысы) (экструдированный) ПК-120 ГОСТ Р 51849-2001 Р.5 (ООО «Лабораторкорм», Россия).

Условия окружающей среды

Содержание животных и работа с ними проводились в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 и Европейской Конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18.03.1986).

Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (18–26 °C, относительная влажность — 30–70%). Температура и влажность постоянно контролировались в каждой экспериментальной комнате. В комнатах содержания животных поддерживался 12 часовой цикл освещения и 10-кратная смена объема воздуха комнаты в час.

Акклиматизация

Животные были адаптированы/акклиматизированы в лаборатории в течение 7 дней до начала эксперимента, осуществлялся ежедневный осмотр внешнего состояния животных.

Распределение по группам

В экспериментальную группу были отобраны животные без каких-либо внешних признаков отклонений от нормы, так чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения в пределах пола более чем на ± 10%, и средние значения массы тела в группах значимо не отличались.

Идентификация животных

Каждой группе крыс (по времени декапитации) был присвоен индивидуальный номер, фиксируемый на карточке клетки. Внутри каждой группы крыс метили фукорцином.

Расчет дозы

Крысам 1 и 2 групп вводили суспензию клозапина из расчета 150 мг/кг. Объем вводимой суспензии представлен в табл. 3.

Таблица 3