Р. Т. Маннапова

Микробиология. Практикум для выполнения лабораторно-практических работ

Учебник

ebooks@prospekt.org

Информация о книге

УДК 579(076.5)

ББК 28.4я73

М23

Автор:

Маннапова Р. Т. – доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и иммунологии Российского государственного аграрного университета — Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Рецензенты:

Ларионова О. С., – доктор биологических наук, доцент, заведующая кафедрой микробиологии, биотехнологии и химии ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова»;

Дюльгер Г. П., – доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой морфологии и ветеринарии ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет – Московская сельскохозяйственная академия им. К. А. Тимирязева».

В учебнике изложены методы морфологических, физиологических исследований микроорганизмов, лабораторной диагностики инфекционных болезней, микозов и микотоксикозов животных, санитарной микробиологии, серологических и иммунологических методов исследований, методов молекулярной диагностики. По каждой теме представлена теория вопроса, описаны материалы и оборудование, методика выполнения, даны задания для выполнения работы и вопросы для контроля знаний. В конце учебника представлен тестовый контроль знаний по всем изложенным темам. Для облегчения усвоения материала приведен терминологический словарь. Имеются приложения.

Содержание практикума позволяет выбирать темы исходя из региональных особенностей и состояния животноводства в целом по Российской Федерации.

Учебник предназначен для подготовки магистров/бакалавров с учетом требований программы ФГОС ВО по направлению 36.04.01/36.03.01 «Ветеринарно-санитарная экспертиза»..

УДК 579(076.5)

ББК 28.4я73

© Маннапова Р. Т., 2018

© ООО «Проспект», 2018

Посвящается светлой памяти
моих родителей –
Тимергалея Фахразетдиновича
и Нурзиды Динисламовны Рафиковых

Предисловие

Учебник «Микробиология» предназначен для магистров и (или) бакалавров с учетом требований программы федеральных государственных образовательных стандартов высшего образования (ФГОС ВО) по направлению 36.04.01/36.03.01 «Ветеринарно-санитарная экспертиза» при выполнении лабораторных и практических занятий. Он может быть также использован при подготовке специалистов по направлению 36.05.01 «Ветеринария» аспирантами, работниками ветеринарных лабораторий и служб в ходе научных исследований и факультативных занятий.

Издание имеет форму удобного практикума и позволяет преподавателям названных дисциплин выбирать темы с учетом местных особенностей, состояния животноводства как в регионе, так и в целом в Российской Федерации, а также современных международных требований к подготовке востребованных конкурентоспособных специалистов для ветеринарии.

Практикум состоит из четырех разделов.

В разделе I «Общая микробиология: морфология и физиология микроорганизмов» рассматриваются принципы работы в микробиологической лаборатории, виды микроскопирования, инструкции по приготовлению питательных сред, приемы стерилизации, вопросы морфологии, физиологии, биохимии и антибиотикорезистентности микроорганизмов.

Раздел II «Инфекционные болезни животных, микозы и микотоксикозы» содержит темы лабораторно-практических занятий (ЛПЗ), посвященных основным инфекционным болезням, микозам и микотоксикозам, диагностику и профилактику которых современному магистру/бакалавру, ветеринарно-санитарному эксперту, а также специалисту — ветеринарному врачу необходимо уметь выполнять в первую очередь — для своевременного принятия мер по их профилактике, ликвидации последствий, предупреждения заражения людей через животноводческую продукцию, обеспечения населения экологичной и здоровой продукцией животного происхождения.

В разделе «Санитарная микробиология» представлены темы ЛПЗ по санитарно-микробиологическим методам исследования воды, почвы и воздуха.

Раздел IV «Иммунология. Серологические и иммунологические методы исследований» включает темы ЛПЗ, посвященные серологическим (РА, РП, РСК, МФА, РН) и современным иммунологическим методам исследований клеточных и неспецифических факторов иммунитета, фракционирования и идентификации иммуноцитов, метаболической активности фагоцитов и активности в них миелопероксидазы, а также НСТ-тестам, определению классов иммуноглобулинов, ЦИК (циркулирующий иммунный комплекс), РБТЛ (реакция бласттрансформации лимфоцитов) и РТМЛ (реакция торможения миграции лимфоцитов). Дается доступное представление о методах полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА), определения цитокинов — медиаторов межклеточного взаимодействия в иммунном ответе методом ИФА.

Издание много внимания уделяет самостоятельной подготовке студентов по представленному материалу. В конце учебника по всем представленным темам ЛПЗ для лучшего освоения изучаемого материала предлагаются вопросы и ответы для тестового контроля знаний. С целью облегчения восприятия специальной терминологии приведен терминологический словарь.

Лучшему освоению материалов, выносимых на самостоятельное изучение, будут способствовать данные в заключительной части учебника четыре приложения:

1) «Превращение микроорганизмами соединений углерода» — включает темы молочно- и маслянокислого, а также спиртового брожения;

2) «Превращение микроорганизмами соединений азота» — содержит темы, касающиеся процессов азотфиксации, аммонификации, нитрификации и денитрификации;

3) «Рецепты приготовления красителей и индикаторов»;

4) «Рецепты приготовления растворов».

Все включенные в практикум темы и приложения изложены по общей схеме: цель занятия, материалы и оборудование, теоретические сведения, методический материал для выполнения работы, задания для самостоятельной работы, вопросы для самоконтроля знаний.

Практикум составлен в классическом стиле, для наглядности иллюстрирован фотоматериалами (в виде цветных и черно-белых фотографий, электроннограмм) и таблицами с краткими сводками по ключевым аспектам микробиологии и иммунологии.

Необходимость подобного практикума очевидна. Она вытекает из потребностей смежных наук (физиология, биохимия, зоогигиена, генетика, акушерство, ВСЭ, патологическая анатомия, экология) и другие дисциплины, для которых знания по микробиологии и иммунологии при подготовке магистра/бакалавра в области ветеринарно-санитарной экспертизы являются базовыми.

Надеемся, что учебник удовлетворит запросы студентов, аспирантов, преподавателей, научных сотрудников, а также всех, кто сочтет представленные в нем материалы нужными и полезными.

Автор выражает искреннюю признательность рецензентам за ценные замечания и пожелания по улучшению практикума и всем тем, кто проявил интерес и оказал помощь в его подготовке.

Замечания и пожелания к изданию можно присылать по адресу: 126434, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К. А. Тимирязева, кафедра микробиологии и иммунологии, Маннаповой Р. Т.

Список сокращений

АГ — антиген

АМФ — альвеолярные макрофаги

АПК — антигенпрезентирующая клетка

АТ — антитело

БГКП — бактерии группы кишечной палочки

БЦЖ — вакцина Кальметта—Герена

ВГНКИ — Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

ГАС — генерализованный адаптационный синдром

ГЗТ — гиперчувствительность замедленного типа

Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ—КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ДПН — дифосфопиридиннуклеотид

Е-РОК — метод «спонтанных розеток»

ЕАС—РОК — метод розеткообразования

ЖСА — желточно-солевой агар

ИД — инфекционная доза

ИФА — иммуноферментный анализ

ИЛ — интерлейкин

ИЭФ — иммуноэлектрофорез

КАМ — комплементный антиген из атипичных микобактерий

ККРНГА — кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации

КСФ — колониестимулирующий фактор

КР — кольцевая реакция агглютинации с молоком

КУА — казеиново-угольный агар

ЛД — летальная доза

ЛТФ-130 — лиофилизированная вакцина против трихофитии крупного рогатого скота

МАФАМ — мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микробы

МАС — местный адаптационный синдром

МБцК — минимальная бактерицидная концентрация

МПА — мясопептонный агар

МПБ — мясопептонный бульон

МПЖ — мясопептонный желатин

МПК — минимальная подавляющая концентрация

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота

МФА — метод флюоресцирующих антител

2-МЭ — 2 меркаптоэтанолом (для обработки сывороток)

НСТ-тест — тест с нитросиним титразолием

ОМЧ — общее микробное число

ПЖА — полужидкий мясопептонный агар

ПМФ — перитониальные макрофаги

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РА — реакция агглютинации

РБП — проба с бенгальским розовым

РБТЛ — реакция бласттрансформации лимфоцитов

РДП — реакция диффузной преципитации

РИФ — реакция иммунной флюоресценции

РК — реакция Кумбса

РКП — реакция кольцепреципитации

РМА — реакция микроагглютинации

РН — реакция нейтрализации

РНГА — реакция непрямой гемагглютинации

РНК — рибонуклеиновая кислота

РП — реакция преципитации

рРНК — рибосомальная рибонуклеиновая кислота

РСК — реакция связывания комплемента

РТГА — реакция торможения гемагглютинации

РТПХ — реакция «трансплантат против хозяина»

СЖН — сафранино-железо-новобиоционовая среда

СПМ — санитарно-показательные микроорганизмы

тРНК — транспортная рибонуклеиновая кислота

ФНО — фактор некроза опухоли

ФСБР — фосфатно-солевой буферный раствор

ФЭВ — ферментативное экстрагенное вещество

ЦИК — циркулирующий иммунный комплекс

ЧБК — чистая бактериальная культура

BCR — рецептор В-лимфоцита

Ig — иммуноглобулин

MHC — главный комплекс гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex, произносится «эм эйч си»)

NK — естественный киллер (от англ. natural killer)

pH — концентрация водородных ионов

TCR — рецептор Т-лимфоцитов

Раздел I. Общая микробиология: морфология и физиология микроорганизмов

Тема 1. Знакомство с микробиологической лабораторией. Техника безопасности при работе в микробиологической лаборатории. Оптическая и иммерсионная системы микроскопа. Морфология микроорганизмов

1.1. Цель занятия

Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории. Усвоить технику безопасности и личной профилактики. Освоить правила работы со световым, люминесцентным и электронным микроскопами и особенности иммерсионной системы. Изучить основные формы и разнообразие бактерий.

1.2. Материалы и оборудование

Микроскопы, окрашенные микроскопические препараты для ознакомления с разнообразием форм микробов, штативы, сливные чашки с мостиками, пробирки, красители, бактериологические петли, пастеровские пипетки, песочные часы, колбы с дистиллированной водой, банки с дезинфицирующими растворами для отработанных препаратов, иммерсионное масло, салфетки для снятия иммерсионного масла с объектива. Мультимедийное устройство, презентация и таблицы по теме.

1.3. Теоретический материал

1.3.1. Основная задача ветеринарных бактериологических лабораторий

Основная задача — диагностика болезней сельскохозяйственных животных, пушных зверей, птиц, рыб, пчел, а также проведение санитарной экспертизы сырья и продуктов животного происхождения, других пищевых продуктов, кормов.

Бактериологические лаборатории размещают вдали от проезжих дорог в специализированном здании. В лаборатории предусматривают приемное отделение, бактериологический, вирусологический, серологический, биохимический, токсико-микологический и патологоанатомический отделы, помещения для бокса (для выполнения работы в стерильных условиях), для термостатов, стерилизации посуды и питательных сред, для мытья посуды, весовую, складские помещения. Имеется здесь и виварий для содержания лабораторных животных. Предусматриваются также кабинет заведующего, раздевалки, комнаты для специалистов, обслуживающего персонала, помещения для библиотеки и др.

В моечной комнате должны быть металлические столы, раковины, газовые или электрические плиты, шкафы (вытяжной, сушильный) и др. Наличие вытяжного шкафа необходимо для удаления паров воды и некоторых реактивов, используемых при мойке посуды. Полы и стены полагается облицовывать плиткой.

В комнате для стерилизации размещают автоклавы, печи Пастера, аппараты Коха, столы. Она должна хорошо вентилироваться. Пар из автоклава до подъема давления выводят через резиновую трубку во внешнюю среду. Дверь (без стекла) и окна должны открываться наружу.

Комната для приготовления питательных сред должна быть облицована плиткой, пол выстлан плиткой или покрыт линолеумом. В этой комнате размещаются газовая или электрическая плита, холодильник, столы, шкафы, ящики с отсеками для сред, компонентов сред.

В термостатной комнате размещают термостаты. Они бывают разных форм и размеров. Температура в термостате обычно составляет для культивирования плесневых грибов 20–35 °С, многих сапрофитов — 25–30 °С, возбудителей инфекционных болезней — 35–37 °С, термофилов — 40–45 °С.

Препараторская — помещение для подготовки оснащения и исследуемого материала к лабораторно-практическим занятиям.

Бокс — комната, в которой осуществляются посевы и пересевы культур микроорганизмов в стерильных условиях. Он герметично застеклен, имеет предбоксник с раздвижной дверью. Стены бокса должны быть облицованы плиткой или окрашены белой масляной краской, пол — покрыт плиткой или линолеумом. Уборку в боксе производят с применением дезинфицирующих средств (3–5%-ным раствором фенола, 2–3%-ным раствором натрия гидрокарбоната). В боксе устанавливаются бактерицидные лампы (БУВ-15, БУВ-30 и др.). Стерилизацию воздуха осуществляют от 30 мин до нескольких часов, в зависимости от степени загрязненности. Ультрафиолетовые лучи вызывают острое воспаление роговицы глаз, поэтому нельзя находиться в комнате с включенной бактерицидной лампой или необходимо пользоваться специальными защитными очками.

В виварии содержат лабораторных животных: белых мышей, белых крыс, морских свинок, а также кроликов барана-донора.

Реактивы и некоторые биологические препараты при необходимости хранят в специально отведенном подвальном помещении или темном сухом стенном шкафу при невысокой температуре.

1.3.2. Правила работы и техника безопасности в ветеринарных бактериологических лабораториях

1. В помещение входить только в халате и белой шапочке.

2. Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи, продукты.

3. В помещении лаборатории запрещается пить, принимать пищу.

4. Перед началом работы о замеченных недостатках, неисправностях приборов, горелок, посуды студенты сообщают преподавателю или лаборанту.

5. Запрещается зажигать одну горелку от другой.

6. Нельзя касаться проводов и контактных частей электросети металлическими и другими предметами. Не включать любую электроаппаратуру без разрешения преподавателя или лаборанта.

7. Любой используемый для учебных занятий материал должен рассматриваться как особо опасный.

8. При работе с бактериологическим материалом придерживаются общепринятых правил, исключающих возможность инфицирования.

9. В ходе распаковки любого присланного для исследования материала необходимо соблюдать осторожность (банки снаружи обтирать ватой, смоченной дезинфицирующим раствором, ставить только на подносы).

10. При работе с жидким инфицированным материалом используют резиновые баллоны с пипеткой. Инфицированные жидкости переливают над посудой с дезинфицирующим раствором.

11. Вскрытие трупов лабораторных животных производят в специальных халатах, на оборудованном столе, с помощью необходимых инструментов, используя кювету, залитую парафином. Инструменты после работы помещают в стакан с дезраствором или обжигают на пламени горелки. Нельзя класть на стол!

12. В случае случайного попадания патологического материала на стол его немедленно удаляют тампоном с дезинфицирующим раствором. При попадании материала на кожу, конъюнктиву, слизистую ротовой полости принимают срочные меры к обеззараживанию.

13. По окончании работы патологический материал, культуры микроорганизмов, поверхность стола, инструменты подвергают обеззараживанию. Материал, использованный в работе, в конце занятия студенты сдают преподавателю, а рабочее место приводят в порядок.

14. Перед уходом из лаборатории необходимо снять халат, вымыть руки и обработать их 70-градусным этиловым спиртом.

1.3.3. Устройство светового микроскопа и работа с ним

Микроскоп — оптический прибор для исследования объектов, невидимых невооруженным глазом. В световом микроскопе различают механическую и оптическую части.

К механической части относятся: подошва (основание), предметный столик, тубус, тубусодержатель, конденсор с ирисовой диафрагмой, макрометрический винт, микрометрический винт, винт конденсора, «револьвер» (узел смены объективов). К оптической части — зеркало, или осветительное устройство (источник света, зеркало), окуляр, объективы.

Подошва обычно цельнометаллическая с прямоугольной (подковообразной) ножкой для обеспечения устойчивости микроскопа. Она соединена с коробкой с механизмом микрометрической фокусировки.

Предметный столик по форме может быть прямоугольным или круглым. На нем закреплены клеммы-зажимы для фиксации предметных стекол или препаратоводитель (в современных микроскопах). При отсутствии препаратоводителя по краям предметного столика вставлены центровочные винты для перемещения столика.

С другой стороны коробки с помощью кремальеров прикреплен тубусодержатель, в верхней части которого расположен «револьвер», состоящий из двух пластин и соединенный с тубусом. Верхняя пластинка закреплена неподвижно, а нижняя имеет гнезда для ввинчивания объективов; она вращается.

Тубус может быть прямым или наклонным. В верхнюю часть тубуса вставляется окуляр. Передвижение тубусодержателя осуществляется с помощью винтов. Макрометрический винт служит для нахождения объекта на препарате путем грубой наводки, а микрометрический — для установления четкости изображения. Полный оборот микровинта поднимает или отпускает тубусодержатель на 0,1 мм.

На барабане микрометрического винта имеется 50 делений (каждое деление соответствует перемещению системы на 2 мкм). Макрометрическая фокусировка состоит из системы зубчатых колес и рычага. Поэтому обращаться с винтом нужно аккуратно и не вращать до упора. При вращении рукояток макро- и микрометрического винтов по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, против часовой стрелки — поднимается.

Зеркало или осветительное устройство необходимо для направления лучей света в микроскоп.

Объективы — система линз, закрепленных в металлической оправе (их количество доходит до 10). Передняя (фронтальная) линза — основная, самая малая, производит основное увеличение, остальные (коррекционные) исправляют искажения оптического изображения. Объективы делят на ахроматы и апохроматы. Ахроматы имеют дефект — хроматическую аберрацию, при которой происходит разложение света на составные части спектра. У апохроматов нет этого недостатка. Они имеют большое количество линз из стекла разного химического состава.

Различают сухие и иммерсионные (погруженные в масло или воду) системы объективов. При сухой системе между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом находится прослойка воздуха, а при работе с иммерсионным объективом на исследуемый мазок наносится иммерсионное масло, и объектив погружают в масло (чаще всего в кедровое, реже в касторовое, гвоздичное) или воду (при специальном объективе). Предметное стекло, на котором сделан препарат, и кедровое масло имеют почти одинаковые показатели преломления света (1,25 и 1,51 соответственно). Поэтому лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, за счет чего при иммерсионной системе объектива создается большее увеличение, чем при сухой системе. Показатель преломления света касторового масла равен 1,48–1,49, гвоздичного — 1,53, смеси касторового и гвоздичного масел — 1,515. А показатели преломления света воздуха и стекла значительно отличаются: 1,0 и 1,52 соответственно.

Рис. 1.1. Строение светового микроскопа

Поэтому при сухой системе объектива регистрируются значительное преломление и потеря лучей света, а следовательно, меньшее увеличение исследуемого на препарате объекта.

В иммерсионных объективах отмечаются короткое фокусное расстояние и большое увеличение. Здесь расстояние между фронтальной линзой и препаратом невелико, поэтому пользоваться этой системой нужно аккуратно во избежание повреждения линзы и препарата. Иммерсионные объективы (х90) имеют пружинную оправу, что исключает повреждение фронтальной линзы и препарата при их соприкосновении. Обозначения сухих линз: ×8, ×20, ×40.

Окуляры (от лат. oculus — глаз) расположены в верхней части тубуса. Они заключены в металлическую оправу и состоят из двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклыми сторонами к объективу. Между линзами располагается металлическая диафрагма. Линза, обращенная к глазу, называется глазная, к объективу — собирательная (полевая). Короткие окуляры дают более сильное увеличение, длинные — слабое. В зависимости от этого окуляры обозначаются: ×7, ×10, ×15, ×20. Общая увеличивающая способность микроскопа равна произведению увеличения объектива на увеличение окуляра (при увеличении объектива ×90 и окуляра ×20 увеличение микроскопа равно 1800).

Разрешающая способность микроскопа — это величина, обратная тому наименьшему расстоянию, на котором могут быть видны раздельно два соседних элемента структуры. Это одна из важных характеристик микроскопов, в том числе электронных. Самая высокая разрешающая способность у просвечивающих микроскопов. Они превосходят по этому параметру световые микроскопы в несколько тысяч раз. Высокое разрешение у электронных микроскопов достигается очень малой длиной волны электронов. Чем короче длина волны источника излучения, тем выше разрешающая способность микроскопа. Она составляет 1350 (90×15).

Осветительный аппарат состоит их трех элементов — конденсора Аббе, диафрагмы и зеркала. Конденсор Аббе имеет две линзы, заключенные в металлическую оправу. Он собирает лучи света, идущие от зеркала, в один мощный пучок. Ирисовая диафрагма служит для регулирования пучка света, то есть освещения препарата путем ее сужения или расширения с помощью специального винта. Поэтому окрашенные препараты, частично задерживающие свет, лучше изучать при открытой диафрагме; неокрашенные препараты (висячую или придавленную каплю) — с полуоткрытой диафрагмой (в слабом пучке света). Это дает возможность увеличивать контрастность неокрашенных форм микробов. В микроскопах серии «Биолам» вставлена дополнительная откидная линза в оправе. Ее необходимо использовать при работе с объективами малого увеличения. Плоское зеркало применяется при хорошем естественном освещении в микрофотосъемках, вогнутое — при искусственном и слабом естественном освещении.

Микроскоп МБИ-1 имеет наклонный и вертикальный тубусы. Наклонным тубусом исследуют объекты на горизонтальной поверхности предметного столика. Макро- и микрометрический винты находятся в нижней части штатива. При их вращении руки лежат на столе, и длительная работа не вызывает усталости. Бинокулярные микроскопы МБР-3, «Биолам» и другие имеют два наклонных тубуса, что позволяет рассматривать препарат обоими глазами.

Эти микроскопы дают плоское увеличение. В настоящее время применяются объемные микроскопы, которые позволяют рассматривать исследуемый объект в трех измерениях. Это достигается путем смены фокусного расстояния 50 раз в минуту, создавая оптическое впечатление объемности.

В проекционных микроскопах большое значение имеет освещенность препаратов. Чем она выше, тем лучше видимость. К ним относится лазерный микроскоп с мощным усилителем света, который в отличие от других подобных источников не разрушает биологические объекты и позволяет проецировать изображение на экран.

1.3.4. Работа с иммерсионной системой

Объективы малого увеличения (×3,5, ×8, ×9) используют для предварительного осмотра препарата, объективы среднего увеличения (×20, ×40) — для изучения крупных клеток микроорганизмов (например, грибов). Эти объективы называются сухими, поскольку при микроскопии между фронтальной линзой и препаратом находится воздух. При этом благодаря различию показателей преломления воздуха (n = 1) и стекла (n = 1,52) часть лучей, освещающих препарат, рассеивается и не попадает в объектив.

Объективы больших увеличений (×85, ×90) — иммерсионные. При работе с ними необходима максимальная освещенность препарата. Устранение рассеивания, неизбежного при работе с сухими объективами, в данном случае достигается путем использования иммерсионных жидкостей, у которых показатель преломления близок к показателю преломления стекла (рис. 1.2).

Вначале под малым увеличением микроскопа наводят свет и определяют на препарате участок микроскопирования. Затем на выбранное место наносят каплю кедрового масла и осторожно (под контролем глаз с боку) погружают в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива (×90).

По окончании работы объектив поднимают, убирают препарат, а с фронтальной линзы кусочком фильтровальной бумаги убирают остатки масла. Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 2,3 мм), поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания его, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат и повредить фронтальную линзу. После грубой наводки, которую выполняют с помощью макрометрического винта, руки переводят на микрометрический винт и осуществляют более точную фокусировку.

Рис. 1.2. Схема лучей в иммерсионной системе: 1 — объектив микроскопа; 2 — предметное стекло; 3 — объект исследования;4 — иммерсионное масло; 5 — лучи света; 6 — фронтальная линза объектива

1.3.5. Морфология микроорганизмов

По форме бактерии делят на три основные группы — шаровидные (кокки), палочковидные и извитые (рис. 1.3).

Шаровидные (кокки). В эту группу входят в основном факультативно анаэробные, редко подвижные, не образующие спор микробы. Кокки являются грамположительными микробами. В зависимости от расположения клеток после деления подразделяются на:

• микрококки — кокки, расположенные единично или беспорядочно, их диаметр не превышает 0,5 мкм. В эту группу входят сапрофиты, обитатели воды, воздуха;

• диплококки — кокки, которые делятся в одной плоскости, как результат деления одной особи, и располагаются попарно. Они неподвижны, не образуют спор.

Имеются сапрофитные формы (в почве, водоемах), а также патогенные — пневмококки, менингококки и др.

Стрептококки — (гр. streptos — цепочка) делятся в одной плоскости, и образующиеся клетки не разъединяются, располагаясь в цепочки разной длины. Грамположительные, не образуют спор. Их делят на патогенные — возбудители многих инфекционных болезней, фекальные (энтерококки) — обитатели кишечника; молочнокислые — встречаются на различных растениях, в молоке, используются для получения молочнокислых продуктов.

Стафилококки — (гр. staphilиs — гроздь) делятся в разных плоскостях, образуя беспорядочные скопления клеток, иногда напоминающие грозди винограда. Это грамположительные факультативные анаэробы, не образующие спор. Являются возбудителями (чаще S. aureus) различных гнойно-воспалительных процессов (абсцессов, флегмон, фурункулов, карбункулов, остеомиелитов, гнойных плевритов, ангин, сепсиса, маститов и др.), пищевых токсикоинфекций и т.д.

Тетракокки — кокки, располагаются по четыре, деление у них происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях.

Сарцины (гр. sarcio — соединяю) — кокки, соединенные в виде пакетов в результате деления клеток в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Среди них болезнетворных видов не обнаружено.

Тетракокки и сарцины в основном почвенные микроорганизмы.

Палочковидные бактерии. Самая многочисленная и разнообразная группа. Палочковидные микроорганизмы подразделяются на бактерии, бациллы и клостридии. Их размеры колеблются от нескольких долей микрометра до 10–15 мкм и более. Различают короткие, длинные, тонкие и толстые палочки. Концы у них могут быть закруглены или резко обрублены. Некоторые палочковидные бактерии имеют разветвленную (микобактерии) или овоидную форму, характерную для пастерелл. Они могут располагаться одиночно или беспорядочно, группироваться попарно (диплобактерии, стрептобациллы). Встречаются как сапрофитные, так и патогенные виды.

Бактерии — имеют цилиндрическую форму и не образуют спор (например, возбудители туберкулеза, бруцеллеза, рожи свиней, листериоза).

Различают палочковидные формы бактерии, которые образуют споры. Среди спорообразующих существуют собственно бациллы и клостридии.

Рис. 1.3. Основные формы бактерий: а — микрококки; б, в — диплококки; г — стрептококки; д — стафилококки; е — тетракокки; ж — сарцины; з, и, к — палочки; л — вибрионы; м — спириллы

Бациллы — спорообразующие палочки, по типу дыхания аэробы, т.е. для своего развития нуждаются в свободном молекулярном кислороде. Грамположительные, образующие при неблагоприятных условиях (вне организма) споры. Диаметр споры меньше ширины клетки. Большинство из них сапрофиты, некоторые служат возбудителями болезней (напр. Bac. аntracis — возбудитель сибирской язвы).

Клостридии — спорообразующие палочки, по типу дыхания анаэробы, диаметр споры превышает ширину микробной клетки. Поэтому в процессе спорообразования клостридии изменяют свою конфигурацию.

Термин «клостридии» происходит от греческого слова closter — веретено. Они являются возбудителями клостридиозов: эмфизематозного карбункула, злокачественного отека, брадзота, столбняка, ботулизма и др.

Извитые формы. Это тонкие бактерии, тело которых спиралевидно изогнуто. Извитые бактерии разделяются на вибрионы, спириллы и спирохеты. По величине они бывают крупными (более 5 мкм), средними (1–4 мкм) и мелкими (0,5 мкм).

Вибрионы — имеют форму запятой, поворот тела вокруг оси не превышает четверти оборота. Они могут встречаться в различных таксономических группах (возбудители кампилобактериоза сельскохозяйственных животных и холеры человека).

Спириллы — характеризуются небольшим числом крупных завитков (1–3). Передвигаются с помощью жгутиков. Грамотрицательные, подвижные, факультативные — аэробы.

Спирохеты — имеют штопорообразную форму с большим количеством завитков. Грамотрицательные, обладают активной подвижностью. На конце тела имеются жгутики, расположенные в виде пучка.

1.4. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с бактериологической лабораторией, основным оборудованием бактериологических отделов ветеринарных лабораторий, правилами техники безопасности при работе в бактериологических лабораториях.

Задание 2. Изучить устройство светового микроскопа, ознакомиться с принципами иммерсионной и темнопольной микроскопии.

Задание 3. Провести микроскопию готовых окрашенных препаратов, определить и зарисовать основные формы микроорганизмов.

1.5. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Основные задачи ветеринарных бактериологических лабораторий.

2. Основные отделения ветеринарных лабораторий, принцип их устройства, оснащения оборудованием.

3. Принцип работы с иммерсионной системой микроскопа.

4. Какие различают основные морфологические признаки бактерий?

5. Каковы основные правила работы в микробиологической лаборатории?

6. Какие части микроскопа относятся к оптическим? Дайте им характеристику. Как определяется общая увеличивающая способность микроскопа?

7. Какими составными частями представлен осветительный аппарат и каково их назначение?

8. Каковы назначения и правила работы с макро- и микрометрическими винтами?

9. Каковы особенности работы при люминесцентной микроскопии?

10. Какие вы знаете группы шаровидных бактерий в зависимости от их расположения?

11. На чем основано деление бактерий на собственно бактерии, бациллы и клостридии?

12. Какие морфологические группы имеются среди извитых форм?

Тема 2. Приготовление, фиксация и окраска препаратов. Микробиологические краски. Простые и сложные методы окрашивания микроорганизмов (по Граму, по Цилю–Нельсену)

2.1. Цель занятия

Ознакомиться с техникой приготовления препарата для микроскопии из культуры микробов. Приготовить, окрасить препарат простым методом и зарисовать в рабочей тетради разные формы микробов. Отработать методику сложных методов окраски (по Граму, по Цилю — Нельсену).

2.2. Материалы и оборудование

Микроскопы, растворы красок, пробирки с культурами микробов, спирт этиловый 96°, дистиллированная вода, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, фильтровальные бумаги, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, готовые окрашенные препараты с разными формами микробов. Мультимедийное устройство, презентация и таблицы по теме.

2.3. Теоретический материал

2.3.1. Приготовление препаратов

Для обнаружения и изучения тинкториально-морфологических свойств микроорганизмов необходимо приготовить препараты из исследуемого материала, окрасить их и изучить под микроскопом.

Препараты готовят на предметных стеклах. Материалом служат взвеси бактериальных культур, выросших на питательных средах, мясо, молоко. Из них готовят препараты-мазки, а из тканей и органов — препараты-отпечатки.

Предметные стекла должны быть чистыми, хорошо обезжиренными. Их хранят в банках с притертыми пробками в смеси 1:1 этилового спирта и эфира или в 96-градусном этиловом спирте.

Препараты готовят с помощью бактериологической петли или пастеровской пипетки.

Порядок приготовления препарата для микроскопии: обезжиривание предметного стекла, приготовление мазка, высушивание его на воздухе, фиксация и окраска мазка.

Обезжиривание предметного стекла. Новые предметные стекла сначала моют в воде, потом помещают в смесь спирта и эфира фламбируют над пламенем горелки (обезжиривают). Также новые предметные стекла можно готовить кипячением в течение 10 мин в 1%-ном растворе натрия гидрокарбоната (соды), с последующим промыванием в дистиллированной воде с добавлением 0,5% соляной кислоты (для нейтрализации) и окончательным споласкиванием в дистиллированной воде.

Приготовление мазка. С целью приготовления препарата — мазка из бульонной культуры на предметное стекло бактериальной петлей наносят исследуемый материал и равномерно распределяют в пределах предварительно начерченной границы мазка. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют.

С помощью стерильных пастеровских пипеток готовят препараты-мазки из жидкостей и бульонных культур. Для этого заранее над пламенем горелки отламывают запаянный конец пипетки и набирают материал. Каплю исследуемого материала наносят на предметное стекло, распределяют пипеткой в пределах начерченной границы. Затем пастеровскую пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Высушивание готовых препаратов проводят при комнатной температуре.

Для приготовления препарата-мазка из бактериальной культуры, выращенной на плотной питательной среде, с помощью бактериальной петли на предметное стекло наносят небольшую каплю стерильного физиологического раствора. Затем петлю фламбируют (стерилизуют над пламенем горелки в вертикальном положении). Из пробирки с культурой микробов мизинцем и ладонью правой руки вынимают пробку (рис. 2.1).

Пробирку с культурой микробов необходимо держать левой рукой пробкой к себе. Затем вынимают пробку, обжигают края пробирки и вносят в нее бактериологическую петлю. Ее охлаждают, касаясь стенок пробирки, и только потом забирают материал. Петлю с бактериальной культурой вынимают осторожно, не касаясь края пробирки; материал вносят в приготовленную ранее каплю физраствора, размешивают в ней и равномерно распределяют по стеклу в пределах границы мазка в виде небольшого овала или круга. По окончании приготовления мазка бактериальную петлю вновь прокаливают над пламенем горелки.

Фиксация мазка. Фиксацию мазка проводят физическим и химическим способами.

Физический способ фиксации — над пламенем горелки. При этом методе предметное стекло с мазком берут большим и указательным пальцами или пинцетом, проводят три-четыре раза над пламенем горелки, каждый раз прикладывая стекло к коже руки. Ощущение легкого жжения свидетельствует о том, что мазок фиксирован. При этом способе фиксации микробы погибают и плотно прикрепляются к стеклу.

Химический способ фиксации мазков применяется при исследовании крови и мазков-отпечатков из тканей и органов, так как под влиянием высоких температур разрушаются клетки. Для этого препараты погружают в фиксирующую жидкость: в этиловый спирт — на 10 мин, в смесь Никифорова (спирт плюс эфир, 1:1) — на 15 мин, в метиловый спирт — на 5 мин, в ацетон — на 5 мин.

Цель фиксации: а) убить микробы; б) закрепить их на стекле; в) убитые микробы вследствие коагулирования белка клетки лучше окрашиваются.

Рис. 2.1. Схема приготовления препарата-мазка

2.3.2 Окраска мазка

Для окрашивания микробов используют анилиновые красители. Чаще всего употребляют следующие красители: красные — фуксин, сафранин, нейтральрот; синие — метиловый, опаловый или водный синий; фиолетовые — метилвиолет, кристаллвиолет, генцианвиолет; зеленые — малахитовая или бриллиантовая зелень; коричневые — хризоидин, везувин; черная — нигрозин.

При простом методе окрашивания применяется только один краситель, чаще всего это фуксин или метиленовая синь. На охлажденный фиксированный мазок наносят раствор краски, выдерживают 3–5 мин, затем краску смывают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсионной системой микроскопа. Этот способ окраски позволяет определить наличие микробов в исследуемом материале, установить их форму и взаиморасположение.

Для сложных способах окрашивания требуются растворы нескольких красок и реактивов. Они основаны на физико-химических различиях состава бактерий. Сложные способы позволяют: определить морфологию микробов, установить их тинкториальные особенности (разное окрашивание при использовании специальных методов), наличие или отсутствие структурных элементов клетки (капсула, спора) и др. Это специальные методы исследований. К сложным способам окрашивания относятся: окраска по Граму (дифференцирует микробы на грамположительные и грамотрицательные), по Цилю –Нельсену (на микобактерии туберкулеза), по Козловскому (на бруцеллез), по Михину и по Ольту (на капсулы), по Златогорову и Пешкову (на споры).

2.3.3. Окраска по Граму

Метод Грама (модификация по Синеву). Этот метод позволяет разделить все микроорганизмы на две группы: грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр–).

На фиксированный мазок помещают:

1.Кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной 1%-ным спиртовым раствором генцианвиолета, наносят 2–3 капли воды и окрашивают 2–3 мин. Затем снимают бумагу, мазок не смывают. На этом этапе все микробы на препарате окрашиваются в фиолетовый цвет.

2.Наносят раствор Люголя на 2 мин, смывают водой. Раствор Люголя содержит йод, который фиксирует фиолетовое окрашивание Гр+ микробов.

3.Обрабатывают 96-градусным этиловым спиртом, выдерживают в течение 20–30 с и тщательно смывают мазок водой. Спирт обесцвечивает за такое короткое время Гр- микробы.

4.Докрашивают мазок фуксином в течение 2–3 мин и смывают водой.Грамотрицательные окрашиваются в розовый цвет.

5.Высушивают на воздухе и микроскопируют.

Микроскопическая картина: грамположительные микробы фиолетового цвета, а грамотрицательные — розового (рис. 2.2, а).

Окраска микроорганизмов по этому методу зависит от химического состава клеточной стенки (наличие муреина и частично липида) и цитоплазмы, pH среды, от различия в строении бактериальной стенки у Гр+ и Гр– микробов.

2.3.4. Окраска по Цилю — Нельсену

На фиксированный мазок наносят небольшой кусок фильтровальной бумаги, на него — раствор карболового фуксина. Снизу препарат подогревают над пламенем горелки до появления паров и оставляют на «мостике» 5–7 мин. Затем краску с бумагой убирают (не промывая). Наносят 3–5%-ный раствор серной кислоты, окрашивают 5–7 мин, хорошо промывают водой. Затем добавляют раствор метиленовой сини (по Леффлеру), окрашивают 4–5 мин. Препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: кислотоспиртоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), некислотоустойчивые — в синий (первоначально окрасившись фуксином в красный цвет, легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают дополнительную окраску метиленовой сини) — рис. 2.2, б.

Рис. 2.2. а — окраска по Граму; б — окраска по Цилю — Нельсену

2.4. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур микробов.

Задание 2. Окрасить готовые препараты простым методом (фуксином или метиленовой синькой), по Граму, по Цилю — Нельсену, зарисовать.

2.5. Вопросы для самоконтроля знаний

1.Какие красители применяются в микробиологии?

2.Какие имеются способы фиксации? В чем состоит цель фиксации?

3.Какова последовательность приготовления препарата для микроскопии?

4.В чем особенность простого метода окрашивания? Что позволяет установить простой способ окрашивания?

5.Как проводится обработка предметных и покровных стекол для приготовления препарата?

6.Какие существуют методы фиксации? Почему применяют разные методы фиксации мазка?

7.Чем обусловлено разное окрашивание бактерий по Граму?

8.Каково действие спирта при окрашивании по Граму?

9.Какова особенность окраски по Цилю – Нельсену?

10.При диагностике каких заболеваний применяется окраска на споры, капсулы по Граму и по Цилю — Нельсену?

Тема 3. Методы окрашивания спор и капсул. Исследование бактерий на подвижность

3.1. Цель занятия

Освоить методы окрашивания препаратов на капсулы и споры. Приготовить, окрасить препараты по Златогорову на споры. Освоить методы определения подвижности микроорганизмов на препаратах придавленная и висячая капля. Зарисовать в рабочих тетрадях полученные результаты.

3.2. Материалы и оборудование

Микроскопы, растворы красок, спирт этиловый 96-градусный, предметные стекла, бактериологические петли, пробирки с культурами микробов, сливные чашки, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, пинцеты, мостики, карандаши по стеклу, или маркеры, часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, окрашенные препараты на капсулы, мультимедийное устройство, презентация и таблицы по теме.

3.3. Теоретический материал

3.3.1. Окраска спор.

Существует несколько методов окрашивания на споры. Все они включают три основных этапа: прокрашивание споры концентрированными растворами красок, обесцвечивание вегетативной части клетки, докрашивание вегетативной части клетки.

Окраска спор по Златогорову. 1. На фиксированный мазок наносят карболовый фуксин, окрашивают 5–10 мин. Происходит прокрашивание споры. На этом этапе спора и вегетативная часть клетки приобретают красный цвет.

2. Наносят 2%-ный раствор серной кислоты, выдерживают 2–3 с. Происходит обесцвечивание вегетативной части клетки, споры остаются красными.

3. Затем наносят раствор метиленовой сини, окрашивают 3–5 мин. Вегетативная часть клетки приобретают синий цвет

Микроскопическая картина: споры красного цвета, вегетативные формы — синие (рис. 3.1, а).

Рис. 3.1. а — окраска спор по Златогорову; б — окраска капсул по Михину

3.3.2. Окраска капсул

Капсула — толстый слизистый слой вокруг бактериальной клетки, муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, который синтезируется в цитоплазме и секретируется на поверхности клеточной стенки.

Только сильно патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и от антител. Размеры их превышают тело микробной клетки. По химическому составу у одних видов микробов капсулы состоят из комплекса белков, у других — полисахаридов. Капсула и сама микробная клетка имеют разный химический состав, поэтому при окрашивании одной краской они приобретают разные цвета (сама бактериальная клетка красится в цвет применяемой краски, капсула приобретает какой-либо оттенок).

Правила окрашивания капсул:

1. Капсула быстро лизируется, поэтому материал должен быть свежим.

2. Мазок фиксируют химическим методом.

3. Для окрашивания используют метахроматические краски.

4. Препарат следует быстро промыть водой.

Окраска капсул по Ольту. На фиксированный мазок наносят:

• 2%-ный раствор сафранина (лучше свежий), окрашивают 5–7 мин;

• быстро смывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тело микробной клетки окрашивается в кирпично-красный цвет, капсула — в желтый.

Окраска капсул по Михину. На фиксированный мазок наносят:

• метиленовый голубой Леффлера, окрашивают 2–3 мин при подогревании;

• быстро смывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: вегетативное тело микробной клетки окрашивается в синий цвет, капсула приобретает розовый оттенок (рис. 3.1, б).

3.3.3. Определение подвижности микроорганизмов

У микробов различают пассивное и активное движение. Пассивное — передвижение с частичками пыли, с водой, с воздухом, на теле человека и животных, с транспортом. Активное движение — за счет жгутиков. Жгутики бывают разной длины. Их диаметр очень мал (менее 0,2 мкм), и они невидимы в световом микроскопе. Жгутики исследуют в неокрашенных препаратах для наблюдения за движением микробов. В зависимости от расположения и количества жгутиков микроорганизмы делят на:

а) монотрихи — имеют один жгутик на одном конце. Совершают умеренные поступательные движения (псевдомонас);

б) лофотрихи — содержат несколько или множество (пучок) жгутиков на одном конце. Совершают активные поступательные движения (листерии). Обладают самой большой скоростью движения;

в) амфитрихи — жгутики расположены по одному или по несколько (возможен пучок) на обоих полюсах микробной клетки. Микробы передвигаются путем передергиваний то в одну, то в другую сторону;

г) перитрихи — жгутики расположены по всей поверхности микробной клетки, передвигаются беспорядочно, переворачиваются, кувыркаются (кишечная палочка).

Для изучения подвижности исследуют суточные культуры микробов. Старые культуры утрачивают способность передвигаться. Для исследования подвижности микробов готовят препараты «висячая капля» и «придавленная капля».

Приготовление препарата «висячая капля». Препарат готовят на предметном стекле с луночкой (углублением). Края луночки смазывают вазелином. На покровное стекло наносят каплю культуры из жидкой среды. Если культура выращена на плотной питательной среде, то на покровное стекло наносят каплю физиологического раствора, а затем перемешивают в ней культуру бактерий. Предметное стекло переворачивают и аккуратно опускают на покровное стекло, чтобы капля оказалась в центре углубления. Затем предметное стекло возвращают в прежнее положение. На препарате капля остается в закрытой влажной камере, подвешенной на внутренней поверхности покровного стекла. Для увеличения контрастности препарат исследуют в затемненном поле.

Рис. 3.2. Типы расположения жгутиков у бактерий

Приготовление препарата «придавленная капля». Каплю бактериальной культуры наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, слегка придавливают пальцем и микроскопируют.

3.4. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур микробов.

Задание 2. Окрасить препараты на споры по методу Златогорова, зарисовать.

Задание 3. Изучить подвижность культур бактерий на препаратах «висячая» и «придавленная» капля.

3.5. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какова особенность окраски препаратов на споры?

2. Что такое спора? При каких условиях микробы образуют споры?

3. Какие вы знаете методы окрашивания капсул?

4. Что представляет собой капсула? Где и почему микробы образуют капсулу? Какие микробы образуют капсулу?

5. Какие различают микроорганизмы на основании расположения жгутиков?

6. Как микроорганизмы исследуют на подвижность?

7. Как осуществляется процесс образования спор у микробов?

Тема 4. Питательные среды для культивирования микроорганизмов. Приготовление основных питательных сред. Техника посева

4.1. Цель занятия

Ознакомиться с техникой приготовления основных питательных сред, применяемых в ветеринарных лабораториях. Ознакомиться с термостатами для культивирования микроорганизмов. Освоить методы посевов микроорганизмов на жидкие и плотные питательные среды (МПБ и «косой» МПА в пробирке), а также метод рассева на чашке Петри с МПА.

4.2. Материалы и оборудование

Компоненты для приготовления питательных сред: агар-агар, пептон, желатина, химически чистый NaCl, сухие питательные среды — полуфабрикаты, колбы с МПБ, МПА, пробирки с готовыми МПБ, МПА («косой агар), чашки Петри с МПА, бактериальные петли, шпатели, карандаши по стеклу, горелки, спички.

Пробирки с культурами микроорганизмов, смесь микробов в физиологическом растворе Bac. Subtilis, Васillus mesentericus, Bac. mycoides, мультимедийное устройство, презентация и таблицы по теме.

4.3. Теоретический материал

4.3.1. Требования к питательным средам

Основные требования, предъявляемые к питательным средам:

1) наличие необходимых питательных веществ (белки, углеводы, органические кислоты, многоатомные спирты, пептон, микро- и макроэлементы, витамины и др.);

2) оптимальная концентрация водородных ионов (рН), окислительно-восстановительного потенциала (Еh), активности воды (аw) осмотического давления;

3) стерильность — отсутствие живых микробов до посева;

4) прозрачность — для наблюдения за ростом микробов.

4.3.2. Классификация питательных сред и способы их приготовления

Питательные среды классифицируют по критериям исходных компонентов, химического состава, консистенции, целевого назначения. В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают:

Среды неопределенного химического состава:

1) животного происхождения (исходные продукты — мясо, молоко, яйца, рыба и т.д.);

2) растительного происхождения (исходные продукты — картофель, морковь, горох, соя и т.д.).

Некоторые продукты используют в натуральном виде (картофель, молоко, морковь и т.д.), но чаще животные и растительные ткани подвергают обработке (ферментативному или кислотному гидролизу, экстрагированию).

Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (углеводы, аминокислоты, соли, витамины и т.д.) в оптимальном соотношении. Синтетические среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред. По физическим свойствам питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными и сыпучими.

Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы из исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные среды. Жидкие питательные среды уплотняют внесением желатины и агар-агара.

Агар-агар — продукт переработки морских водорослей, полисахарид. Плавится при 80–86 °С, затвердевает при 40 °С. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5–3%, полужидких — 0,3–0,7% (рис. 4.1).

Рис. 4.1. Агар-агар: а — водоросли Gracilaria и Gelidium — два основных источника для производства агар-агара; б — сухие пластинки агар-агара; в — агар-агар в порошке

Желатина — готовят экстракт из переработанных костей, хрящей, сухожилий, связок, содержащих в большом количестве коллаген. Желатиновый гель плавится при 25 °С, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37–38 °С. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину. В питательные среды вносят 10–20% желатины. На МПЖ делают посев уколом. Среда применяется для исследования на аэробиоз.

По целевому назначению различают общеупотребительные (основные), обогащенные, специальные, дифференциально-диагностические, элективные (избирательные) питательные среды.

Общеупотребительные (основные) среды. Это среды, в которых культивируют неприхотливые микробы.

В качестве компонентов для приготовления основных сред применяют мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.

Мясная вода — говядину освобождают от костей, связок, сухожилий, жира и готовят фарш. Фарш заливают 2 л водопроводной воды и кипятят 1,5 ч. Мясную воду охлаждают, фильтруют и доливают воду до первоначального объема. Затем разливают по емкостям, закрывают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют при 120 °С 20 мин.

Перевар (гидролизат) Хоттингера. Мясо (1 кг) нарезают кусочками по 1–2 см и опускают в кастрюлю с 2 л кипящей воды. Кипятят 20 мин, затем извлекают и готовят фарш. В оставшейся жидкости устанавливают рН 8,0, опускают в нее фарш, охлаждают до 40 °С и добавляют поджелудочную железу (в виде фарша, дважды пропущенную через мясорубку) из расчета 100 г на 1 л жидкости (или 0,5 г сухого панкреатина). Тщательно размешивают и через 30 мин снова подщелачивают (отсутствие сдвига реакции в кислую сторону указывает на недоброкачественность фермента). После установления рН смесь переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой (1/3 бутылки оставляют свободной) и вносят 1–3% хлороформа (в холодное время года меньше), закрывают пробкой, хорошо встряхивают и на минуту вынимают пробку для освобождения от избытка паров хлороформа. Через 1–2 ч после добавления фермента опять проверяют реакцию и устанавливают рН 7,4–7,6. Смесь оставляют на 10–16 дней при комнатной температуре или 7–10 дней при 37 °С. Первые 3–4 дня переваривания ежедневно проверяют и исправляют реакцию, перевар встряхивают не менее 3 раз в сутки. В дальнейшем встряхивать можно реже. За 1–2 дня до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы перевар отстоялся. Переваривание прекращают по следующим признакам: на дне бутылки собирается пылевидный осадок, надосадочная жидкость просветляется и принимает соломенно-желтый цвет, реакция на триптофан с бромной водой положительная (максимальное содержание триптофана 2,00–3,00 г/л), в гидролизате содержится 11,00–12,00 г/л азота (7,00–9,00 г/л аминного азота). После окончания гидролиза перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, разливают в бутылки, колбы и стерилизуют в автоклаве при 120 °С в течение 30 мин. Далее используют по назначению.

Мясопептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 10 г пептона и 5 г химически чистого хлорида натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании 15–20 мин, устанавливают рН 7,2–7.4, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и пробирки. Стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин. Содержание аминного азота в готовой среде — 1,2 г/л.

Мясопептонный агар (МПА). К 1 л мясопептонного бульона прибавляют 15–25 г (1,5–2,5%) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая до полного растворения агар-агара. Устанавливают рН 7,4–7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120 °С в течение 20–30 мин. Чтобы получить скошенную поверхность агар-агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят) (рис. 4.2).

Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандартной чашки Петри — около 10 см; они бывают разных диаметров, выпускают также одноразовые пластиковые стандартные стерильные. Над пламенем горелки наливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45–50 °С питательного агар-агара, чашки помещают на горизонтальную поверхность до застывания агар-агара.

Рис. 4.2. Приготовление скошенного агара

Полужидкий мясопептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агар-агара. Кипятят при помешивании до полного расплавления агар-агара, устанавливают рН 7,2–7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.

Мясопептонная желатина (МПЖ). К 1 л МПБ добавляют 10–20 г желатины, нагревают до ее расплавления, устанавливают рН 7,2–7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112 °С 15 мин.

Бульон Хоттингера. Перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1:5–1:8 (до содержания аминного азота 120 мг%), добавляют 1,5% хлорида натрия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4–7,6, кипятят 15–20 мин, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °С 20–30 мин.

Агар Хоттингера. К 1 л бульона Хоттингера вносят 15–25 г (1,5–2,5%) агара. Кипятят перемешивая до полного растворения агара. Устанавливают рН 7,4–7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин.

Предприятия биологической промышленности выпускают среды полуфабрикаты — готовые питательные бульоны и агар в виде сухого порошка.

Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах или предъявляют особые требования к питательным средам. В этой связи в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т.д. Такие питательные среды получили название обогащенных.

Кровяной МПА — питательная среда для выявления гемолитических свойств бактерий. К расплавленному остуженному (до 45–50 °С) питательному агару асептически добавляют 5–10% дефибринированной крови, хорошо перемешивают и сразу же разливают в чашки Петри. Вокруг выросших колоний отчетливо видны прозрачные зоны гемолиза.

Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогичным образом. Если микробы обладают гемолитическими свойствами, среды обесцвечиваются.

Для получения дефибринированной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стеклянными бусинками, встряхивают вращательными движениями 15–20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин наслаивается на бусинки.

Специальные среды. Это среды, разработанные с учетом специфических потребностей микробов.

Мясопептонный печеночный бульон (МППБ) Китта — Тароцци (рис. 4.3). Мясо или печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным объемом МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4–7,6) и 30 мин кипятят. Затем среду фильтруют, печень (мясо) промывают водопроводной водой, подсушивают фильтровальной бумагой. По 3–4 кусочка мяса (печени) помещают в пробирку, наливают 7–8 мл бульона, покрывают слоем вазелинового масла и стерилизуют при 120 °С 20 мин. Перед использованием среду регенерируют (кипятят с последующим охлаждением).

Рис. 4.3. Мясопептонный печеночный бульон (МППБ) Китта–Тароцци

Мозговая среда (МС). Свежий мозг (не позже чем через 18 ч после убоя животного) очищают от пленок и пропускают через мясорубку. Мозговой фарш заливают водопроводной водой (1 часть мозгового фарша на 1 часть воды) и протирают через сито. Реакция протертой массы должна быть нейтральной или слабощелочной. Стерилизуют текучим паром в течение 2 ч. Затем раскладывают по пробиркам высоким столбиком и стерилизуют в течение 2 ч при 110 °С. Для более быстрого почернения мозговой среды при культивировании анаэробов рекомендуется добавить 0,05% сернокислого железа.

Основной перфрингенс-агар (пропись фирмы «Дифко», 1982). Среду используют для изготовления TSC- или SFP-arapa при предварительной идентификации и подсчете Сl. perfringens. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 15 г триптозы, 5 г соевого пептона, 5 г мясного экстракта (сухого), 5 г дрожжевого экстракта, 1 г натрия метабисульфита, 1 г железа аммонийно-цитратного, 14 г агара. Устанавливают рН 7,6, стерилизуют при 121 °С 10 мин. Затем среду охлаждают до 50 °С и вносят соответствующие селективные добавки.

Бульон Вейнберга для анаэробов. 1 кг бычьего сердца пропускают через мясорубку, добавляют к фаршу 1 л воды, нагревают до кипения, охлаждают, снимают жир. Смешивают 400 г печени, 400 г свиных желудков, 40 г соляной кислоты, 4 л воды, подогретой до 50 °С, и выдерживают при этой температуре 18–24 ч. Затем подогревают до 100 °С, жидкость сливают, фильтруют, добавляют 0,2% двуосновного фосфорнокислого натрия и устанавливают рН 7,4. Затем смешивают 1 л мясной воды из сердца быка и 2 л полученного пептона, устанавливают рН 7,8–8,2 и стерилизуют при 120 °С 30 мин. Бульон разливают по пробиркам с кусочками вареной печени, наливают стерильное вазелиновое масло слоем 0,5 см и вновь стерилизуют при 120 °С 30 мин. Перед посевом к бульону добавляют стерильный раствор глюкозы до 0,5%.

Бульон и агар Мартена. Для приготовления среды Мартена используют продукты переваривания свиных желудков (или сычуга рогатого скота). Желудки очищают от жира, фасций, измельчают в мясорубке и заливают водой 1:4 с добавлением к общему объему жидкости 1%-ной соляной кислоты. Смесь выдерживают сутки при 50 °С, нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH до щелочной реакции (посинение лакмусовой бумажки), автоклавируют при 120 °С 15 мин. Затем смешивают равные количества полученного перевара и мясной воды, кипятят 10 мин, подщелачивают 20%-ным NaOH до рН 7,9, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, колбам и автоклавируют при 0,5 атм. 30 мин. Для приготовления плотной среды к полученному бульону Мартена добавляют 2–3% агара, определяют рН, фильтруют, как обычный МПА, стерилизуют при 0,5 атм. 30 мин.

Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для дифференциации одних видов микробов от других по выявлению ферментов. В состав этих сред кроме питательной среды входит субстрат для обнаружения фермента и индикатора, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата. К дифференциально-диагностическим относятся среды Эндо, Гисса, Левина, Плоскирева и др.

Среда Эндо (рис. 4.4, б) — дифференциально-диагностическая среда для выделения и идентификации кишечных бактерий. В ее состав входят: 1% пептона, 1% лактозы, 35% К₂НРO₄, 1,5% агара. Все ингредиенты, за исключением лактозы, растворяют в воде при кипячении или в автоклаве. Во избежание карамелизации сахара лактозу добавляют после растворения всех остальных компонентов среды. Кроме лактозы, среда не должна содержать никаких других углеводов, поэтому при ее изготовлении нельзя применять мясную воду. Для этого используют любой пептон или гидролизат белков. Индикатор готовят ex tempore и добавляют к расплавленной питательной основе. Среда может быть использована сразу после приготовления без предварительной стерилизации. При необходимости ее стерилизуют в течение 30 мин при температуре 110 °С, рН среды — 7,4–7,6.

Индикатором служит соединение основного фуксина с сернистокислым натрием. Приготовление индикатора: 0,25 г безводного сернистокислого натрия или 0,5 г кристаллического (из расчета на 100 мл среды) растворяют в 5 мл дистиллированной воды и добавляют спиртовой (1–2%) раствор основного фуксина до тех пор, пока раствор из красного не превратится в бледно-розовый.

Приготовленный индикатор добавляют к расплавленной питательной основе и после тщательного перемешивания среду разливают в стерильные чашки Петри, которые подсушивают в термостате при 37 °С в течение 30 мин в открытом состоянии. Готовая к употреблению среда Эндо имеет бледно-розовый цвет либо бесцветна; она должна быть использована в течение суток, так как при длительном хранении происходит ее покраснение, и она становится непригодной.

Колонии бактерий, сбраживающих лактозу (кишечная палочка), на среде Эндо приобретают интенсивный красный цвет с металлическим оттенком. Бактерии, не сбраживающие лактозу (тифопаратифозные и дизентерийные) формируют колонии бесцветные либо цвета окружающей среды.

В среде Эндо основной фуксин, в химическом отношении являющийся производным солянокислого розанилина, при соединении с сернистокислым натрием вследствие редуцирования обесцвечивается. При росте бактерий, разлагающих лактозу, промежуточный продукт (ацетальдегид), возникающий в результате окисления сахара, реагирует с сернистокислым натрием, и фуксин вновь приобретает красный цвет.

Биофабрики выпускают и сухой агар Эндо. При изготовлении среды Эндо берут 5 г порошка на 100 мл дистиллированной воды, нагревают до его растворения и, прокипятив 5 мин, разливают в стерильные чашки Петри.

Необходимо помнить, что фуксин обладает бактериостатическим действием, которое более выражено при температуре 37 °С. Поэтому учет результатов следует производить через 24 ч после инкубации в термостате и 24–48 ч выдерживания посевов при комнатной температуре.

Среда Гисса («пестрый ряд», рис. 4.4, а) — используют для выявления сахаролитической активности энтеробактерий. В дистиллированной воде растворяют 1% пептона и 0,5% поваренной соли. Затем прибавляют 1% индикатора Андреде (кислый фуксин в растворе NaOH) или 0,1% спиртового раствора бромтимолового синего и нагревают до 80 °С. Затем при комнатной температуре доводят рН до 7,2. Смесь кипятят 5 мин, фильтруют и доливают водой до первоначального объема. Добавив 1% одного из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.), среду разливают по пробиркам с поплавками для улавливания газообразных продуктов, образующихся при расщеплении углеводов.

При изготовлении полужидких сред Гисса следует добавлять 1% углеводов и 0,4% агара. Среды стерилизуют в течение 3 дней текучим паром по 30 мин или автоклавируют 15 мин при 0,5 атм. Среду Гисса выпускают полужидкой с индикатором BP (смесь водного голубого и розоловой кислоты).

Среда Левина (рис. 4.4, в) — цветная элективная среда для дифференцирования микроорганизмов кишечной группы, аналогична среде Эндо, но содержит индикатор эозин с метиленовой синью. Стабильна при хранении в течение нескольких дней. Наличие в среде лактозы позволяет выделять патогенную микрофлору, не способную разлагать этот углевод. Входящие в состав среды Левина органические красители задерживают рост сапрофитов, что позволяет использовать среду для непосредственного засева исследуемого материала.

Наиболее удобно впрок раздельно подготовить основную среду, растворы лактозы и красителей и смешивать их перед применением.

Основная среда: 1) 10 г пептона; 2) 15 г агара; 3) 2 г К₂НРO₄; 4) 1 л воды дистиллированной. Разливают по 100 мл и стерилизуют при 120 °С в течение 15–30 мин.

Дифференциальная среда: на каждые 100 мл расплавленной основной среды добавляют при помешивании следующие растворы, приготовленные на дистиллированной воде и простерилизованные дробно текучим паром три дня подряд. Ингредиенты: 1) 20%-ный раствор лактозы — 5 мл; 2) 2%-ный раствор эозина бактериологического — 2 мл; 3) 0,5%-ный раствор метиленового синего — 1,5 мл. Среду разливают в чашки Петри, подсушивают. Готовая среда имеет сине-фиолетовый цвет. При отсутствии пептона среду можно готовить на основе перевара Хоттингера (рН = 7,2–7,3). Широкое применение нашла сухая среда Левина, выпускаемая промышленностью.

Патогенные бактерии кишечной группы, не разлагая лактозы, растут на среде Левина в виде мелких, круглых, прозрачных, чаще бесцветных колоний, иногда с розоватым или голубоватым оттенком. Кишечная палочка образует на среде Левина небольшие гладкие колонии темно-синего цвета. У молодых колоний окраска может наблюдаться только в центре. Протей растет в виде небольших оранжево-желтых колоний, цвет среды вокруг колоний изменяется. Колонии других бактерий подобной картины не дают.

Агар Плоскирева — дифференциально-диагностическая и селективная среда, способствует лучшему росту некоторых бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерий) и подавляет рост других (кишечная палочка). Содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, соли желчных кислот, минеральные соли (цитрат натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, кальцинированная сода, хлорид натрия) и индикато — нейтральный красный. Навеску порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розовая. Лактозонегативные колонии вырастают бесцветными, лактозопозитивные — красными. На некоторых модификациях среды Плоскирева выявляется еще и способность сальмонелл выделять сероводород: выросшие колонии чернеют.

Молоко (обезжиренное) — естественная среда животного происхождения. Его слегка подщелачивают добавлением 1%-ной двууглекислой соды, проверяют реакцию лакмусовой бумажкой: легкое посинение ее свидетельствует о слабощелочной реакции молока. Фильтруют, разливают в стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром дробно.

Элективные среды. Название происходит от латинского electus — избранный. Это питательные среды для избирательного выделения из материала и накопления микроорганизмов определенного вида. В эти среды вносят компоненты, обеспечивающие рост определенного микроорганизма, но подавляющие рост другой микрофлоры.

Молочно-солевой агар применяется для культивирования стафилококков. К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2–7,4), содержащего 6,0% хлорида натрия, добавляют 10 мл стерильного обезжиренного молока, перемешивают и стерильно разливают в чашки Петри.

Среда Мюллера (рис. 4.4, г) используется для накопления и культивирования сальмонелл. В колбу с 90 мл МПБ вносят 4,5 г мела, перемешивают, автоклавируют при 120 °С 30 мин. Затем вносят 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия — 50 г, дистиллированная вода — 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин.

Среда Олькеницкого для культивирования сальмонелл. Состав: агар питательный сухой — 25 г, лактоза — 10 г, железоаммонийные квасцы (соль Мора) — 0,2 г, тиосульфат натрия — 0,3 г, мочевина — 10 г, 0,4%-ный водный раствор фенолового красного — 4 мл, дистиллированная вода — 1000 мл. Соли предварительно растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в небольших объемах воды при подогревании на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в оставшемся объеме воды при нагревании и помешивании. Затем все компоненты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2–7,4, добавляют индикатор и разливают в пробирки по 6,0–7,0 мл. Среду стерилизуют текучим паром три дня по 20 мин и скашивают, оставляя столбик среды высотой 2,0–2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

Среда Ресселя для выделения сальмонелл: к 100 мл 1,5%-го мясо-пептонного агара (рН 7,2) прибавляют 1% лактозы, 0,1 % глюкозы и 1 мл индикатора Андреде, среду разливают в пробирки по 5,0–6,0 мл, стерилизуют в автоклаве при 112 °С 20 мин и скашивают, оставляя столбик среды высотой 2,0–3,0 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

В состав сухой среды Ресселя входит сухой питательный агар, индикатор ВР, лактоза и глюкоза. Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром два раза по 30 мин. Среду скашивают, оставляя столбик 2,0–2,5 см. Готовая среда фиолетового или розовато-серого цвета. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С 18–20 ч.

Среда Кауфмана — это среда обогащения для сальмонелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1:1000 и 5 мл стерильной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин.

Среда Шустовой — для выделения сальмонелл. К 100 мл расплавленного и охлажденного до 50 °С МПА (рН 7,4) добавляют 10 мл среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2 мл раствора Люголя.

Среда Раппопорт — среда для культивирования сальмонелл. К 100 мл расплавленного до 50 °С МПА добавляют 1 г глюкозы, 10 мл желчи, 1 г индикатора Андраде. Стерилизуют текучим паром.

Казеиново-угольный агар (КУА) с пенициллином (рис. 4.4, д) используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 25 мл панкреатического гидролизата казеина, 5 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 0,002 г хлорида кальция, 0,4 г карбоната натрия, 0,015 г хлорида магния, 0,015 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 1,5 г растворимого крахмала, 0,03 г цистина, 15 г агара. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 атм. 30 мин. Перед использованием в расплавленный до 45 °С агар вносят 3% дрожжевого экстракта, 0,2% сухого активированного угля, 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри.

Растительные питательные среды. Готовят из картофеля, гороха, моркови, капусты и др.

Очищенный картофель нарезают ломтиками цилиндрической формы, затем разрезают по диагонали на две части (плоская поверхность для посева бактерий), погружают в 1%-ный раствор NaHCO₃ на 1–2 ч, затем просушивают фильтровальной бумагой и помещают в пробирки Ру (с перетяжкой в нижней трети). На дно пробирки до перетяжки наливают 5%-ную глицеринизированную воду. Стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Среды из кашицеобразного картофеля и из гороха наибольшее применение нашли в биологической промышленности.

Синтетические среды. Готовят из химически чистых, растворимых в воде веществ, в строго определенных количествах — солей, углеводов, витаминов и др. Синтетические среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.

Среда Ван-Интерсона предназначена для выделения из кормов токсичных грибов, вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохитоксикоз и др. В состав среды входят следующие компоненты: аммоний азотнокислый — 0,5 г; калий фосфорнокислый однозамещенный — 0,5 г; вода дистиллированная — 1000 см. Автоклавируют при 1 атм. 20 мин. Для культивирования грибов широко используют также глюкозный агар Сабуро (рис. 4.4, е) (в 100 мл воды растворяют 4 г глюкозы, 1 г пептона, 1,8 г агара, автоклавируют при 0,5, атм. 20–30мин) и агар Литмана (с бычьей желчью) — на 1 л воды вносят 10 г пептона, 10 г глюкозы, 15 мл обезвоженной желчи крупного рогатого скота, 0,01 мл кристаллвиолета, 20 г агара. Автоклавируют при 120 °С 15 мин. Разливают в чашки Петри толстым слоем.

Рис. 4.4. а — среда Гисса для изучения ферментативных свойств; б — среда Эндо — лактозопозитивные эшерихии; в — среда Левина — лактозопозитивные бактерии образуют колонии фиолетового цвета с металлическим оттенком, лактозонегативные — бесцветные; г – среда Мюллера для культивирования сальмонелл; д — казеиново-угольный агар (КУА) с пенициллином; е — агар Сабуро для патогенных грибов

4.4. Культивирование микроорганизмов

Микроорганизмы, выращенные на питательной среде, называют бактериальной культурой. Для получения культуры из исследуемого материала (кровь, эмульсия тканей, отечная жидкость, гной, молоко и др.) его высевают на стерильные питательные среды в пробирках, колбах или чашках Петри и помещают в термостаты, где постоянно поддерживается необходимая температура. Температурный режим для разных групп микроорганизмов неодинаковый — 37–38 °С, 26–30 °С и 22–25 °С. На биофабриках, где выполняется большой объем работы, имеются термостатные комнаты.

Выращивание микроорганизмов на естественных и искусственных питательных средах проводят при оптимальной температуре. В современных термостатах источником энергии является электричество. Широкое распространение получили суховоздушные термостаты с теплорегулирующим устройством повышенной точности.

Культивирование анаэробов. Анаэробы растут без свободного доступа кислорода воздуха, так как образующийся пероксид водорода (Н₂О₂) окисляет цитоплазму и вызывает гибель микробной клетки. Анаэробы не образуют каталазы, способной разрушать пероксид водорода. Создание анаэробных условий для культивирования анаэробных форм микроорганизмов достигается следующими методами.

Физический метод. Анаэробиоз создается путем механического удаления воздуха с помощью вакуумного масляного насоса. Эксикатор с посевами через манометр соединяют с насосом, с помощью которого отсасывают воздух. После закрытия крана и отсоединения эксикатора его вместе с посевами ставят в термостат для культивирования.

Химический метод. Основан на поглощении кислорода воздуха химическими веществами. Посевы с такими соединениями (пирогаллол и 10%-ный раствор гидроксида натрия) помещают в герметически закрывающийся сосуд (эксикатор, или анаэростат) и ставят в термостат.

Биологический метод. Анаэробы и аэробы выращивают вместе. Для этого плотную питательную среду (МПА) в чашке Петри стерильным скальпелем делят на 2 части путем удаления узкой полоски среды. На одну из них высевают аэробы, на другую — анаэробы. После заливки краев чашки Петри парафином ее ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, которые поглощают весь кислород и создают анаэробные условия, благоприятные для анаэробов.

Комбинированный метод. Анаэробиоз создается путем сочетания нескольких методов. С этой целью используют среду Китта — Тароцци (МППБ) — печеночный бульон, разбавленный 1:3 МПБ с кусочками печеночной, почечной или мышечной ткани. Сверху на среду наливают индифферентное вазелиновое масло. Для удаления газов, в том числе кислорода, среду перед применением нагревают до кипения на водяной бане.

4.5. Способы посева и пересева микроорганизмов на питательные среды

Посев микробиологического материала на питательные среды проводится бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Бактериологические петли перед посевом стерилизуют фламбированием над пламенем горелки или спиртовки. Пипетки стерилизуют в печах Пастера или в автоклаве (предварительно тонкие концы запаивают). В широкий конец пипетки, с которым соприкасаются губы исследователя, для предупреждения попадания материала в ротовую полость, вставляют кусочек стерильной ваты.

4.6. Техника посева

Бактериальную петлю или пастеровскую пипетку держат в правой руке, пробирку — в левой. Мизинцем правой руки пробку прижимают к ладони, извлекают и держат в руке. Петлю вводят в пробирку. На плотной питательной среде материал распределяют зигзагообразно, в жидкой — вращательным движением. При пересеве из одной пробирки в другую бактериальную петлю после введения внутрь охлаждают, забирают культуру и аккуратно извлекают из пробирки, не соприкасаясь с пламенем горелки.

Для посева уколом в пробирку с МПЖ необходимо иметь микробиологическую иглу (лучше пастеровскую пипетку), беспрепятственно проходящую посередине в глубь питательной среды и тут же извлекаемую обратно. На пути прохождения иглы остаются микробы, которые растут по ходу укола.

При посеве в бульонную культуру петлей касаются дна пробирки.

Пастеровскими пипетками берут жидкий материал или культуру, выращенную на жидкой питательной среде. Перед этим пипетку проводят над пламенем спиртовки, стерильным пинцетом отламывают запаянный конец, набирают материал и переносят на питательную среду. Пробирку закрывают над пламенем, а пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью. На пробирках или чашках пишут дату, название органа или культуры, номер акта экспертизы (при проведении научных исследований делают дополнительные пометки. Пробирки помещают в термостат для культивирования.

Для выделения чистой культуры из микробной смеси или материала готовят разведения на изотоническом растворе натрия хлорида и только после этого делают посев на плотную питательную среду в чашки Петри. Петлей или пипеткой на плотную питательную среду наносят каплю смеси и легкими движениями шпателем распределяют ее по всей поверхности. Для того чтобы получить изолированные колонии, внесенную каплю нужно распределить на поверхности среды в нескольких чашках, перенося шпатель из первой во вторую, из второй в третью и т.д.

Шпатель обычно изготавливают из стеклянной палочки в виде треугольника на одном конце. При распределении смеси он легко скользит по поверхности среды. Крышку во время посева открывают по направлению к пламени спиртовки. После посева шпатель фламбируют и ставят в штатив. Чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат. В этом положении исключается возможность слияния колоний (при небольшом количестве они будут находиться на некотором расстоянии друг от друга, изолированно). Затем производят посев материала в пробирки на МПБ и МПА, а также в чашки Петри смесь культур на МПА.

В чашку Петри вносят питательную среду, для чего МПА столбиком расплавляют на водяной бане. Содержимое пробирок выливают в чашки Петри и над пламенем горелки плавными вращательными движениями равномерно распределяют по всей поверхности дна чашки.

Первый студент делает посев на одну чашку, которую со стороны дна делит на 3 сектора и соответственно обозначает цифрами I, II, III. В первый сектор петлей вносят каплю культуры, шпателем смесь сначала распределяют в одном секторе, затем переносят его во второй и третий сектора чашки. Второй студент делает посев на две чашки. Микробную смесь вносят в первую чашку и распределяют шпателем, затем этот же шпатель переносят во вторую чашку. Все чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат. Так можно получить изолированные колонии и выделить культуру в чистом виде.

4.7. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить основные (общеупотребительные) среды.

Задание 2. Приготовить растительные среды.

Задание 3. Провести пересев бульонной и агаровой культур бактерий на скошенный МПА и в МПБ в пробирках.

Задание 4. Провести посев смешанной бульонной культуры на МПА в чашках Петри по методу Дригальского.

Задание 5. Описать характер роста E. coli, S. aureus, B. cereus на МПА (колонии) и на МПБ.

4.8. Вопросы для самоконтроля знаний

1. В чем отличие МПБ, бульона Мартена, Бульона Хоттингера?

2. Каково назначение специальных, дифференциально-диагностических и селективных питательных сред?

3. Что называют культурой микроорганизмов?

4. Что следует понимать под культивированием микроорганизмов?

5. Каковы устройство и назначение термостата и терморегуляторов?

6. Какие применяются методы создания анаэробиоза?

7. Какие среды называются элективными? Раскройте их назначение и применение.

8. Какова техника посева микробов на плотных, жидких и полужидких питательных средах?

Тема 5. Культуральные свойства микроорганизмов

5.1. Цель занятия

Ознакомить студентов с особенностями роста микроорганизмов на жидких, плотных и полужидких питательных средах.

5.2. Оборудование и материалы

Пробирки со стерильными МПБ, скошенным МПА, чашки Петри с МПА; агаровые и бульонные культуры микроорганизмов. Бактериальные петли. Мультимедийное устройство и презентация по теме.

5.3. Теоретический материал

Культуральные свойства микроорганизмов — это характер роста микроорганизмов на питательных средах. Их изучают на жидких, полужидких и плотных питательных средах, с учетом требований микрорганизмов.

На жидких средах учитывают следующие признаки.

Степень помутнения среды — оно может быть обильное, умеренное или скудное.

Наличие или отсутствие поверхностного роста. Поверхностный рост может быть в виде поверхностной пленки или пристеночного кольца. Поверхностная пленка может отсутствовать или быть толстой, тонкой, гладкой, морщинистой и др. в зависимости от вида микроба. Пристеночное кольцо образуют не все виды микробов, оно также может быть разным — выраженным или слабым.

Наличие или отсутствие осадка. Осадок может быть обильным, умеренным или скудным. Затем встряхивают пробирку и определяют характер осадка. По характеру осадок может быть зернистым, хлопьевидным, ватообразным, слизистым (разбивается в виде косички). Микроорганизмы, вырабатывающие пигменты, могут вызвать окрашивание питательной среды и осадка.

На полужидких питательных средах изучают аэробиоз — отношение микробов к кислороду. Аэробы растут в виде «перевернутой елочки», анаэробы — в виде «нормальной елочки», факультативные микробы — в виде «ершика».

На плотных средах сначала определяют наличие или отсутствие роста. В зависимости от скорости размножения микробов рост может быть обильным, умеренным или скудным. Затем выбирают изолированную колонию и изучают ее по следующим признакам, которые являются видовым признаком микробов.

Размер колоний — точечные колонии диаметром менее 1 мм, мелкие — 1–2 мм, средние — 2–5 мм, крупные — более 5 мм.

Форма колоний может быть округлой, овальной и неправильной.

Края колоний бывают ровными и неровными (волнообразными, дубовидными, фистончатыми, с бахромой и др.). Края колоний можно рассмотреть с помощью лупы или микроскопа.

Поверхность колоний может быть гладкой (S-формы) или шероховатой (R-формы).

Рельеф (профиль) — приподнятость колонии над питательной средой. Различают плоский, плоско-выпуклый, выпуклый, конусообразный, куполообразный, с валикообразным утолщением, с углублением и др.

Цвет. В зависимости от пигмента, вырабатываемого микробами, колонии могут быть самых разных цветов: белыми, желтыми, сине-зелеными, красными, коричневыми, кремовыми и др. Многие микробы не вырабатывают пигменты и образуют бесцветные колонии с сероватым оттенком.

Прозрачность. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными и непрозрачными — матовыми.

Консистенция определяется с помощью бактериологической петли. Она может быть сухой — легко крошится; сочной — легко снимается петлей; слизистой — тянется за петлей.

Запах. Многие микробы в процессе культивирования на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества, газы и издают чаще всего неприятные запахи (жженого рога, прогорклого масла и др.)

При необходимости колонии изучают дополнительными методами (например, в косопадающем пучке света для определения пигментации; применение «стандарта мутности» для косвенного определения количества микробов и т.д).

5.5. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Изучить и описать культуральные свойства микроорганизмов на жидких питательных средах.

Задание 2. Определить и описать культуральные свойства микроорганизмов на чашках Петри с МПА.

Задание 3. Ознакомиться с культуральными свойствами на МПЖ и определить аэробиоз.

5.6. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

2. Что такое колония микробов?

3. Каковы культуральные свойства микроорганизмов на плотных питательных средах?

4. По каким признакам исследуют культуральные свойства микроорганизмов на жидких питательных средах?

5. Каковы особенности культуральных свойств микроорганизмов на полужидких питательных средах?

6. Какие существуют методы культивирования анаэробных форм микроорганизмов?

Тема 6. Методы стерилизации (физические, химические и биологические)

6.1. Цель занятия

Ознакомить студентов с основными методами стерилизации, применяемыми в микробиологической практике.

6.2. Оборудование и материалы

Аппарат Коха, печь Пастера, стерилизаторы механические и электрические, автоклавы, вакуумный насос, керамические, асбестовые и мембранные фильтры, колбы, пробирки, чашки Петри, мерные пипетки, объекты для стерилизации. Мультимедийное устройство и презентация по теме.

6.3. Теоретический материал

Стерилизация (лат. sterilis — бесплодный) — обеспложивание, уничтожение микроорганизмов. Различают полную и неполную стерилизацию. Полная стерилизация — уничтожение споровых и вегетативных форм, неполная — уничтожение только вегетативных форм. Существуют физические, химические и биологические методы стерилизации.

Физические методы стерилизации. К ним относят стерилизацию сухим или влажным жаром, фильтрованием, ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком.

К методам стерилизации сухим жаром относятся фламбирование и стерилизация в печах Пастера.

Фламбирование (прокаливание) — стерилизация над пламенем спиртовки или горелки. Этим методом обычно стерилизуют металлические предметы: пинцеты, бактериологические петли, ножницы, скальпель и др.

Стерилизация сухим жаром в печах Пастера. Печь Пастера — двухстенчатый сушильный шкаф. Они бывают разных конструкций. Снаружи облицованы теплонепроницаемым материалом. В верхней части снаружи установлен термометр, который показывает температуру во внутренней камере прибора. Между теплонепроницаемой обшивкой и внутренним металлическим корпусом находится автоматический электронагревательный элемент (обычно внизу). При включении прибора в электросеть воздух внутри него нагревается. Выбирают следующие режимы стерилизации: при температуре 155–160 °С — экспозиция 2 ч, при 165–170 °С — 1–1,5 ч, при 180 °С — 1 ч. По истечении выбранного периода времени нагревание прекращают и, когда температура снизится до 45 °С, шкаф открывают. Это полная стерилизация. В печах Пастера стерилизуют стеклянную посуду, пробирки, чашки Петри, шприцы, металлические инструменты, бактериологические петли, обернутые для последующего сохранения стерильности до применения в работе. Но не все можно стерилизовать в печах Пастера! Нельзя стерилизовать сухим жаром воспламеняющиеся вещества, питательные среды, воду, резиновые предметы.

Стерилизация влажным жаром включает ряд методов.

Кипячение — стерилизация в стерилизаторах, которые представляют собой металлические ванночки с крышкой и вставной решеткой — подставкой. Подставку выстилают двумя-тремя слоями марли или тонким слоем гигроскопической ваты, куда помещают стерилизуемые объекты (шприцы, иглы, ножницы, скальпели и др.). Шприцы стерилизуют в разобранном виде, в иглы вставляют мандрены. Режущие инструменты обертывают марлей или ватой. В стерилизатор наливают воду (лучше стерилизованную) так, чтобы она полностью покрывала инструменты, и добавляют 2%-ный раствор гидрокарбоната натрия. Стерилизатор закрывают крышкой. Кипятят 30–40 мин. После стерилизации воду осторожно сливают, а инструменты, охладив, используют.

Стерилизация текучим паром в аппарате Коха. Сегодня производятся аппараты Коха самых разных конструкций (для нагревания над огнем, электрические, разных форм, но принцип работы у них у всех одинаковый). Это одностенный металлический цилиндр с двойным дном и крышкой с отверстиями для термометра и выхода пара. На дно аппарата наливается вода до уровня водомерной трубки. Внутрь выше помещается решетчатое ведерко со стерилизуемыми объектами. Температуру доводят до 100 °С (момент закипания воды) и выдерживают 30–40 мин. Образующийся пар устремляется вверх непрерывной струей, соприкасаясь с обрабатываемым материалом. Затем выключают аппарат и оставляют на сутки при комнатной температуре, что дает возможность споровым формам прорасти в вегетативные формы. При таком режиме выдерживают три дня подряд. Это позволяет постепенно всем оставшимся споровым формам прорасти в вегетативные. Это полная дробная стерилизация. Стерилизации текучим паром в аппарате Коха подвергают воду, питательные среды в колбах и пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, специально обернутые бактериальные петли, пробирки, инструменты, вату, марлю и т.д.

Тиндализация применяется для стерилизации белоксодержащих веществ. Сущность этого метода такая же, как и у вышеописанного. Он предложен Тиндалем. Стерилизация осуществляется на водяной бане при температуре не более 60 °С, так как при более высокой белок подвергается денатурации. Стерилизация осуществляется в течение 6–7 дней. В первый день при температуре 56–58 °С выдерживают 2 ч, а в последующие дни — по 1 ч. В промежутках между прогреванием стерилизуемый материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы и последующего уничтожения. Эта стерилизация тоже дробная, полная.

Автоклавирование — стерилизация материала насыщенным водяным паром при высокой температуре и давлении выше атмосферного. В процессе автоклавирования соприкосновение насыщенного пара с холодными стерилизуемыми объектами ведет к конденсации и их нагреванию. Температура пара повышается с увеличением давления (давление в 1 атм. соответствует 100 °С; 1,5 атм — 111 °С; 2,0 атм — 121 °С; 2,5 атм — 128 °С; 3,0 атм — 134 °С). При автоклавировании погибают и вегетативные, и споровые формы микробов.

Автоклавы выпускают горизонтальные и вертикальные. Они могут быть разнообразными по форме, конструкции, размерам, рабочему давлению; с ручным управлением, полуавтоматические и автоматические, но принцип их устройства одинаковый.

Автоклав — это двухстенный металлический цилиндр, который сверху покрыт защитным каркасом. Во внутреннюю стерилизационную камеру на специальную подставку помещают материал для стерилизации. От нее наружу выходит кран для выхода воздуха, монометр — для определения давления пара и предохранительный клапан — для выхода пара при увеличении давления выше необходимого. Камера между двумя стенками называется водопаровой. Она заполняется водой (дистиллированной) через специальную воронку, расположенную с наружной стороны автоклава, соединенную с водомерной трубкой, в которой указан уровень воды, выше которого заливать воду не следует (при кипении вода может попасть в трубку монометра и исказить его показание).

В верней части водопаровой камеры имеются отверстия для прохождения пара в стерилизационную камеру. Автоклав закрывается массивной герметичной металлической крышкой с закручивающимися винтами.

Перед работой после осмотра автоклава (нельзя работать при смещении стрелки монометра с нуля, трещине на водопроводной трубе и других неисправностях) в водопаровую камеру наливают воду до верхней отметки на водомерной трубке. В стерилизационную камеру помещают материал для стерилизации (с таким расчетом, чтобы между ними свободно мог проходить пар). Затем закрывают и плотно завинчивают крышку. Открывают кран, который соединяет стерилизационную камеру с наружным воздухом, и включают нагрев. Вода между стенками автоклава закипает, пар поднимается, через верхнее отверстие внутренней стенки проходит внутрь и вытесняет воздух через нижний открытый кран. Началом продувания считается появление непрерывной струи чистого пара. Пока в автоклаве есть воздух, издается сильный треск. Чистый пар выходит с равномерным шипящим звуком. Затем закрывают водоотводный кран и доводят давление до соответствующего режима стерилизации. Монометр показывает избыточное давление, которое создается в автоклаве сверх нормального. Когда стрелка монометра доходит до указателя избыточного давления, температура достигает соответствующего значения. По окончании времени стерилизации в выбранном режиме нагрев автоклава выключают. Давление постепенно падает и сравнивается с атмосферным. И только после этого открывают кран, выводящий пар. Затем открывают крышку (осторожно, не допуская ожога паром лица и рук!). Современные автоклавы для удаления пара из стерилизационной камеры могут быть оснащены вакуумным насосом.

Температуру в автоклаве контролируют с помощью контактных термометров, а также химических веществ — индикаторов температуры, плавящихся при определенной температуре: бензаурин (115 °С), бензонафтол (110 °С), бензойная кислота (121–122 °С), глюкоза (146 °С), сера (119 °С), мочевина (132 °С), тиомочевина (180 °С), аскорбиновая кислота (187–192 °С). На 100 г этих веществ берут 0,01 г красителя (фуксин, метиленовый синий), перемешивают. Пробирки запаивают и устанавливают в вертикальном положении между стерилизуемым материалом. При достижении в сосуде определенной температуры эти вещества расплавляются и приобретают цвет красителя.

Эффективность стерилизации устанавливают высевом спорообразующих микробов, которые выдерживают в автоклаве вместе со стерилизуемыми объектами.

Пастеризация. Этот метод, предложенный Луи Пастером, позволяет сохранить в молоке и других продуктах биологически активные компоненты, в том числе витамины. При пастеризации молока используют тепловую обработку при температуре 65 °С в течение 30 мин, или при 75 °С — 15–40 с, или при 85 °С — 8–10 с. Затем резко охлаждают (до 4–8 °С). При этом погибают практически все болезнетворные микроорганизмы, но остаются термостойкие молочнокислые, споровые формы. Поэтому пастеризованное молоко не может храниться долго (максимум 2 недели) и может закиснуть, его можно использовать для приготовления молочнокислых продуктов. В нем также сохраняется большая часть полезных для организма веществ.

В последнее время все чаще применяют ультрапастеризацию, когда молоко сначала подвергают кратковременному воздействию высокой температуры — 135 °С в течение 3–4 с, а затем медленно охлаждают до 4–5 градусов и разливают в стерильную упаковку. Такое молоко практически не теряет своих полезных качеств и может храниться в упаковке до 2 месяцев.

Стерилизуют молоко при температуре от 120–130 до 130–150 градусов в течение 30 мин. При таком воздействии погибают все микроорганизмы, в том числе молочнокислые; поэтому такое молоко хранится до 1 года и не прокисает, а становится горьким. Ни простокваша, ни творог из него не получатся. Понятно, что и биологическая ценность стерилизованного молока для организма самая низкая.

Стерилизация фильтрованием — стерилизуют среды, которые содержат легкоразрушающиеся или летучие компоненты: витамины, аминокислоты (цистин, цистеин), белки, антибиотики, ароматические углеводы и др. Жидкости стерилизуют фильтрованием через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микробов (фарфор, целлюлоза, асбест, каолин). Фильтры проверяют путем фильтрации суспензии мелких микробов (Serratia marcescens), с последующим посевом ее на питательную среду. Для стерилизации применяют мембранные фильтры: с № 1 до № 4 фирмы «Владипор» (Россия), с № 5 до № 10 фирмы «Синпор» (Чехия), а также марок DA, VC, VM, VF, SLGS, SLHA фирмы «Миллипор» (США).

Широкое применение нашли фильтры Зейтца (рис. 6.1) — плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. В зависимости от диаметра пор различают индексы: ЕКП — поры диаметром 0,8–1,0 мкм, ЕКS-1 — 1,0–1,2; ЕКS — 1,2–1,5; ЕК — 1,5–1,8 мкм. В нашей стране выпускают асбестовые фильтры марок Ф₂, СФ. Стерилизующими являются СФ-3 и СФ-4. Фильтры закрепляют в специальном держателе из нержавеющей стали и зажимают винтами между верхней (цилиндрической) и нижней (воронкообразной) частями.

Рис. 6.1. Фильтровальный аппарат Зейтца: слева — для фильтрации под вакуумом (емкость 30 мл), справа — для фильтрации под давлением (емкость 100 мл)

Трубка воронкообразной части через резиновую пробку вставляется в колбу Бунзена (иногда весь собранный прибор называют фильтром Зейтца).

Также для стерилизации используют свечи Шамберлана (рис. 6.2) из каолина с примесью кварцевого песка. Пористость свечей Шамберлана обозначают буквой L с числами от 1 до 13 (с увеличением числа размер пор уменьшается). Чаще всего в бактериологии употребляют свечи L3–L7 с диаметром максимальных пор от 1,9–2,5 мкм (L3) до 0,9–1,3 мкм (L7). В России выпускают керамические фильтры, аналогичные свечам Шамберлана и имеющие индексы Ф с цифрами, которые обозначают те же самые размеры пор, что и у свечей Шамберлана. Отечественные фильтры выпускают двух размеров: 25 × 205 мм и 16 × 155 мм.

Свечи Беркефельда делают из инфузорной земли — кизельгура (рис. 6.2). В верхней части свечи имеется фарфоровый или металлический сосок для резиновой трубки, через которую отсасывается жидкость. Размер пор у свечей Беркефельда менее однороден, чем у каолиновых, поэтому толщина стенок у них больше. Пористость свечей Беркефельда обозначают буквами: V (крупнопористые, 8–12 мкм), N (нормальная пористость, 5–7 мкм) и W (мелкопористые, 3–4 мкм).

Перед работой фильтры, их держатели и приемник фильтрата стерилизуют. Фильтры Зейтца автоклавируют в собранном виде. Мембранные фильтры стерилизуют в автоклаве при 1 атм 15 мин. Держатель с резиновой пробкой заворачивают в бумагу и автоклавируют при 1 атм 30 мин. Свечи стерилизуют с резиновыми пробками в автоклаве. Колбу Бунзена закрывают ватной пробкой, в отводную трубку вставляют тампон и стерилизуют сухим жаром в печах Пастера.

Рис. 6.2. Схема монтажа фильтровальных свечей: слева — Шамберлана, справа — Беркефельда (1 — фильтруемая жидкость, 2 — фильтровальная свеча)

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами (УФЛ). Для стерилизации УФЛ используют ртутно-кварцевые и аргоно-ртутные лампы. Они работают на принципе газового разряда, который образуется в парах ртути при напряжении тока 127–230 В, подаваемого на электроды лампы. 70% испускаемых лучей представляют ультрафиолетовый спектр с длиной волны 253,7 нм. Ртутно-кварцевые лампы более мощные, но аргоно-ртутные лампы обладают более выраженным бактерицидным действием, что определяет их ценность. Более эффективными аргоно-ртутными лампами являются БУВ-30 (бактерицидная увиолевая, цифра показывает мощность ламп в ваттах). Из ртутно-кварцевых ламп применяют лампы ПРК-2 и ПРК-4, однако они потребляют много электроэнергии. Лампа БУВ — газоразрядная ртутная низкого давления с колбой из увиолевого стекла, прозрачного для коротковолновых УФЛ. Химический состав увиолевого стекла неоднородный (например, А1₂0₃ — 2,89; Fe₂0₃ — 0,01; СаО — 0,08; MgO — 0,09; Na₂O — 4; Si0₂ — 77,94 и В₂0₃ — 44,99%).

Лампа представляет собой стеклянную трубку, имеющую на концах самонакаливающиеся оксидные электроды из двойной вольфрамовой спирали, покрытой карбонатами бария и стронция. В трубке содержится небольшое количество ртути и инертный газ аргон при давлении в несколько миллиметров ртутного столба. При подаче напряжения на электроды в парах ртути происходит разряд и ультрафиолетовое излучение. Рабочее давление паров ртути — не более 0,01 мм рт. ст. Аргон в излучении не участвует. Ультрафиолетовый поток измеряется в бактах (б). Бакт — это единица бактерицидного потока, равная потоку ультрафиолетового излучения с длиной волны 254 нм, мощностью 1 Вт (например, БУВ-30 дает 2,95 б).

Бактерицидные лампы используют для стерилизации воздуха, стен и оборудования в боксах, лабораториях. При работе с бактерицидными лампами глаза должны быть защищены очками из простого стекла. Отечественная промышленность выпускает бактерицидные облучатели: стационарные НБО (настенный бактерицидный облучатель), ПБО (потолочный бактерицидный облучатель) и передвижной МБО (бактерицидный облучатель маячного типа).

НБО представляет собой аппарат комбинированного использования ультрафиолетового облучения. В металлическом корпусе облучателя укреплены две бактерицидные лампы БУВ-ЗОП и пускорегулирующая аппаратура. Лампы разделены экраном-отражателем таким образом, что одна из ламп служит для обеззараживания воздуха в нижней части помещения, другая — в верхней.

ПБО рассчитан на обеззараживание воздуха помещений объемом до 30 м³ в отсутствие и присутствии людей и животных. В корпус облучателя вмонтированы 4 бактерицидные лампы (2 БУВ-15 и 2 БУВ-ЗОП) и пускорегулирующая аппаратура. Для быстрого обеззараживания воздуха включают две нижние неэкранированные лампы БУВ-ЗОП и 2 верхние лампы БУВ-15. Отражатель-экран для этих ламп сконструирован с таким расчетом, чтобы полностью предохранить глаза от вредного воздействия УФЛ. Облучатель монтируется на потолке. Высота помещения должна быть не менее 3 м.

Облучатель маячного типа (МБО) выполнен в виде передвижной модели. Это позволяет использовать его попеременно в различных помещениях. В качестве источников ультрафиолетового излучения выбраны 6 бактерицидных ламп БУВ-30, создающих суммарный бактерицидный поток, равный 19 б.

Для стерилизации дистиллированной воды можно применять установки двух типов: а) дистиллированная вода омывает непосредственно лампу, помещенную в стеклянную трубку с особым составом стекла, и обеззараживается, проходя вдоль трубки; б) с двух сторон стеклянной трубки, по которой проходит вода, располагаются две лампы, защищенные овальными дюралюминиевыми щитками для устранения воздействия излучения на окружающую среду. Такие установки применяют при подаче дистиллированной воды с места получения (перегонная установка) до места потребления (стерилизационная комната) по трубопроводам. Их устанавливают в начале трубопровода.

Стерилизация с помощью ультрафиолетовых лучей лекарственных препаратов, их растворов в ампулах и склянках невозможна, так как обычное стекло поглощает ультрафиолетовые лучи.

Стерилизация ультразвуком применяется для обеззараживания воды, молока, некоторых продуктов, а также кожевенного сырья. Стерилизующее действие ультразвука связано с возникновением в цитоплазме бактерий кавитационных пузырьков, заполненных парами под давлением около 10 тыс. атм, что способствует разрушению внутренней структуры бактерий. В основе летального действия ультразвука на микробы лежит кавитация. В процессе озвучивания бактериальной культуры часть микробных клеток подвергается моментальному разрушению, другая часть — лишь механическому сотрясению, а некоторые клетки под воздействием ультразвука выбрасываются из суспензии и остаются в тумане, находящемся над поверхностью жидкости и не подвергаются воздействию ультразвука. В клетках, подвергшихся механическому сотрясению, происходит разжижение протоплазмы, увеличение клетки в размерах, а затем разрыв клеточной стенки и вытекание содержимого во внешнюю среду. В результате воздействия ультразвука может происходить коагуляция белков внутри клетки и нарушение ее жизненных функций. При таких разрывах из клеток извлекаются токсины, эндотоксины, антигены, ферменты. Действию ультразвука поддаются дрожжевые клетки, светящиеся бактерии, кишечные, тифозные палочки и др. Ультразвук действует различно как на отдельные виды бактерий, так и на разные типы одного и того же вида. Эффект разрушения зависит от вида и типа микроорганизма, от размера микробной клетки, ее физического состояния, от состава среды и продолжительности действия ультразвука. Ультразвук нашел применение для стерилизации в микробиологии, а также для инактивации и дезинтеграции вирусов с целью получения антигенов и вирусных вакцин.

Стерилизация газом –применяется для обеззараживания объектов, которые нельзя подвергать термической или химической обработке (инструменты, имеющие зеркальные поверхности, оптическое и радиоэлектронное оборудование, режущие и колющие инструменты с микронной заточкой, кетгут, предметы одноразового использования и различные изделия из термонеустойчивых синтетических пластмасс (зонды, катетеры и др.). Газовую стерилизацию можно использовать для термостойких предметов. В качестве стерилизационных агентов служат препараты, которые обладают спороцидным действием. Это оксид этилена, метилбромид, формальдегид и др.

Оксид этилена при комнатной температуре представляет собой бесцветный газ с запахом эфира, который в 1,5 раза тяжелее воздуха. При охлаждении до +10,7 °С или с увеличением давления он превращается в бесцветную жидкость. Газообразный оксид этилена в смеси с воздухом взрывоопасен. Если в жидком виде окись этилена растворяет резину, каучук, некоторые пластмассы, то в газообразном состоянии он не вызывает коррозии металлов, порчи изделий из кожи, шерсти, бумаги, резины, пластмасс. Пары обладают высокими проникающими свойствами. В газообразном состоянии оксид этилена является сильным бактерицидным и спороцидным средством. Под действием оксида этилена происходит необратимая деформация белков микроорганизмов и потеря жизнеспособности.

Оксид этилена используют в смеси с метилбромидом (1,0:2,5). Смесь этих газов вводят в герметичные емкости (камеры) газовых стерилизаторов со стерилизуемыми объектами.

Для стерилизации газом объекты разбирают на части, снимают колпаки, мандрены и другие части, тщательно моют моющими средствами, сушат до полного удаления влаги (при комнатной температуре, не используя сушильных шкафов и других термических приборов), помещают в двухслойные пакеты из бумаги, пергамента или полиэтиленовой пленки. Края бумажных и пергаментных пакетов склеивают клеем, а полиэтиленовых — сваривают токами высокой частоты или горячим утюгом через пергамент. Режимы стерилизации указаны в прилагаемой технической документации. Простерилизованные газом изделия применяют только после тщательного проветривания в вентилируемом помещении (объекты, имеющие длительный (свыше 30 мин) контакт с раневой поверхностью — 14 суток; изделия из резины и полимерных материалов — 5 суток, металлические и стеклянные предметы — не менее одних суток.

Химические методы стерилизации. Применяются для консервированию питательных сред, вакцин, лечебных и диагностических сывороток химическими соединениями (соли металлов, щелочи, антибиотики и др.) для предупреждения бактериального загрязнения. Питательные среды консервируют в толуоле, хлороформе, эфире (для освобождения от консерванта среду нагревают до 56 °С). Вакцины и лечебные сыворотки консервируют в 0,25–0,5%-ном растворе фенола, 0,5%-ном растворе хлороформа, 0,5%-ном растворе формалина или в растворе мертиолята (в разведении 1:5000–1:10 000); агглютинирующие сыворотки — в растворах глицерина, толуола, борной кислоты.

Биологические методы стерилизации. Применяются в вирусологии при культивировании вирусов. Стерилизацию проводят с помощью антибиотиков: пенициллин, стрептомицин, нистатин и т.д., которые вносятся в культуры клеток и тканей. Метод основан на том, что вирусы нечувствительны к антибиотикам, они остаются живыми, а микробы погибают, ибо они чувствительны к антибиотикам.

Подготовка лабораторной посуды для стерилизации. Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки.

Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1–10 штук. Пастеровские пипетки по 3–15 штук заворачивают в оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в окружающую среду. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

В верхнюю часть градуированных пипеток, как и в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2–2,5 см и длиной 50–70 см. Полоску кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. При наличии пеналов градуированные пипетки стерилизуют в них.

Лабораторную посуду стерилизуют:

а) сухим жаром при температуре 180 °С — 1 ч, при 160 °С — 2,5 ч;

б) в автоклаве при давлении 1,5 атм — в течение 60 мин, для уничтожения споровой микрофлоры — при давлении 2 атм в течение 90 мин.

Стерилизация шприцев. Шприцы стерилизуют в разобранном виде: отдельно цилиндр и поршень в 2%-ном растворе гидрокарбоната натрия 30 мин. При работе со спороносной микрофлорой стерилизацию производят в автоклаве при 130–132 °С (2 атм.) в течение 20 мин, при 124–128 °С (1,5 атм.) в течение 30 мин. Простерилизованный шприц собирают после того, как он остынет, в цилиндр вставляют поршень, надевают иглу, предварительно вынув из нее мандрен. Иглу, цилиндр и поршень берут пинцетом, который стерилизуют вместе со шприцем.

Стерилизация металлических инструментов. Металлические инструменты (пинцеты, скальпели, ножницы) стерилизуют в 2%-ном растворе гидрокарбоната натрия (предупреждает появление ржавчины и потерю остроты). Лезвия скальпелей и ножниц перед погружением в раствор рекомендуется обертывать ватой.

Стерилизация бактериальных петель. Бактериальные петли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, стерилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания, или фламбирования. Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную, часть пламени горелки, чтобы не произошло разбрызгивание сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Прокаливание занимает 5–7 с.

Стерилизация бумаги, марли и ваты. Вату, марлю, фильтровальную бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160 °С в течение часа или в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 мин. Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочками, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов. Каждый вид материала в отдельности по одной или по несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета стерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается.

Стерилизация резиновых изделий. Изделия из резины (перчатки, трубки и т.д.), загрязненные вегетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2%-ном растворе гидрокарбоната натрия или текучим паром в течение 30 мин; при загрязнении спороносной микрофлорой — в автоклаве при давлении 1,5–2 атм. в течение 30 или 20 мин. Резиновые перчатки перед стерилизацией внутри и снаружи пересыпают тальком (для предохранения их от склеивания). Между перчатками прокладывают марлю. Каждую пару перчаток завертывают отдельно в марлю и в таком виде помещают в биксы.

Стерилизация патогенных культур микробов. Пробирки и чашки, содержащие культуры микробов, не нужные для дальнейшей работы, складывают в металлический бак, пломбируют крышку и сдают на стерилизацию. Культуры патогенных микробов, вегетативные формы, убивают в автоклаве в течение 30 мин при давлении 1 атм. Сдача баков для стерилизации в автоклавную производится специально выделенным лицом под расписку. Режим стерилизации регистрируется в специальном журнале. При уничтожении культур микробов I и II групп патогенности, а также материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями, отнесенными к этим группам, баки с отработанным материалом переносят на металлических подносах с высокими бортами в присутствии сопровождающего лица, допущенного к работе с заразным материалом.

6.4. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с работой автоклава, печи Пастера и аппарата Коха. Определить достоинства и недостатки каждого метода стерилизации.

Задание 2. Смонтировать фильтр Зейтца и простерилизовать жидкость (сыворотку крови) фильтрованием.

Задание 3. Подготовить стеклянную посуду (чашки Петри, колбы и т.д.) и питательные среды для стерилизации.

6.5. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Что такое стерилизация? Какие требования к ней предъявляют?

2. Каковы основные методы стерилизации? Какие методы применяют в практической работе ветеринарные врачи, лабораторные работники?

3. Каково устройство и назначение автоклава? Как контролируется качество его работы?

4. На чем основан метод стерилизации текучим паром? Чем обусловлено его применение?

5. Чем обусловлено применение методов дробной стерилизации?

6. Каково устройство и назначение сушильного шкафа? Какие материалы, при каких температурных режимах стерилизуют сухим жаром?

7. Что представляют собой мембранные фильтры?

8. Как осуществляется контроль температуры в автоклаве?

9. Какова сущность пастеризации и где ее применяют?

10. Как осуществляется подготовка посуды к стерилизации?

11. Каковы особенности стерилизации лабораторной стеклянной посуды, шприцев, металлических инструментов, бактериальных петель, бумаги, марли, ваты, резиновых изделий?

12. Как проводится стерилизация патогенных микробов?

Тема 7. Методы выделения чистой бактериальной культуры микроорганизмов (в аэробных и анаэробных условиях)

7.1. Цель занятия

Освоить методы выделения чистых бактериальных культур аэробных и анаэробных микроорганизмов.

7.2. Оборудование и материалы

Стерильные питательные среды в пробирках и чашках Петри, пастеровские пипетки, бактериальные петли, стеклянные шпатели, физиологический раствор. Бульонные и агаровые культуры E. coli, B. cereus, и S. aureus в пробирках и чашках Петри. Мультимедийное устройство и презентация по теме.

7.3. Теоретический материал

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) клеток, выросших на питательной среде.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Смешанная бактериальная культура содержит два или несколько известных видов микробов.

Загрязненная бактериальная культура содержит помимо известных и неизвестные виды микробов.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

7.3.1. Методы получения чистой бактериальной культуры аэробов

Механические методы:

а) метод Дригальского (метод пластинчатого посева). Этот метод наиболее легко выполнимый. Исследуемый материал бактериологической петлей наносят на поверхность МПА и шпателем растирают на поверхности среды. Этим же шпателем, не обжигая его, растирают (засевают) на поверхности среды второй чашки и т.д. (до 10 чашек Петри с МПА). Культивируют в термостате. Рост изолированных колоний обычно достигается в последних чашках. Выбирают изолированную колонию, которая встречается чаще всего (по культуральным свойствам), и пересевают ее на МПА и МПБ. Так получают чистую бактериальную культуру;

б) метод Пастера (метод разведений). Исследуемый материал последовательно разводят в жидкой питательной среде. С этой целью берут ряд пробирок (до 10) со стерильным МПБ. Пипеткой исследуемый материал вносят в первую пробирку, перемешивают, из нее небольшое количество (0,1 мл) переносят во вторую, после перемешивают и переносят в третью и т.д. Затем берут 10 чашек Петри со стерильным МПА и переносят в них содержимое пробирок. Шпателем каплю растирают равномерно по поверхности среды (каждый раз шпатель фламбируют). Чашки Петри ставят в термостат для культивирования (температура равна 37 °С, на 24 ч). Из последних чашек Петри выбирают изолированные колонии, которые встречаются чаще всего, и пересевают из одной колонии с помощью пастеровской пипетки на свежие питательные среды (МПА, МПБ). Повторно культивируют и получают чистую бактериальную культуру.

Существуют и другие механические методы выделения чистой бактериальной культуры. При отсутствии навыков у экспериментатора изолированные колонии легче получить следующим образом.

Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора (А). Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть 15 с (Б). Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2 и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3 (Г). Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, для того чтобы конденсирующая вода с крышки не попала на поверхность агара (Д). В секторе 1 вырастет большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.

Физический метод. Этот метод применяется для выделения чистой бактериальной культуры спорообразующих видов бактерий. Исследуемый материал выдерживают в водяной бане при 80 °С 30–40 мин. Вегетативные формы микроорганизмов погибают, споры сохраняются жизнеспособными. Далее выбирают любой из вышеописанных методов.

Химический метод. Этот метод основан на бактерицидном или бактериостатическом действии химических веществ на микроорганизмы. Чаще всего его применяют для выделения чистой культуры возбудителя туберкулеза. Исследуемый материал (кусочки пораженных органов вместе с туберкулами) помещают в 10%-ный раствор серной кислоты на 10–20 мин. Все остальные микроорганизмы погибают, а возбудитель туберкулеза является кислотоустойчивым. При посеве такого материала на специальные питательные среды получают чистую культуру микобактерий туберкулеза.

Биологический метод, или биопроба. Биопроба — это заражение лабораторных животных. Исследуемый материал вводят восприимчивому животному (белая мышь, морская свинка, кролик, голубь).

В организме у лабораторного животного развивается, размножается и вызывает заболевание тот микроб, который был патогенным. Лабораторное животное вскрывают, делают посевы из внутренних органов и выделяют чистую культуру.

7.3.2. Методы выделения чистой бактериальной культуры анаэробов

Для выделения чистой бактериальной культуры анаэробных видов создают условия анаэробиоза. Это осуществляется следующими методами:

а) физический — путем удаления воздуха насосом из эксикатора или анаэростата, где помещены питательные среды с посевами анаэробов. После удаления воздуха их культивируют в термостате;

б) химический — используют окислители, поглощающие кислород. Например, по способу Аристовского анаэробные условия создаются путем поглощения кислорода гидросульфитом натрия (Na₂S₂O₄) или пирогаллолом при смешивании их с карбонатом натрия, на поверхность которого насыпают тонким слоем порошок гидросульфита (1,5 г) или пирогаллола (7,5 г). Перемешивают порошок и слегка увлажняют водой с помощью пульверизатора. Одну половину чашки закладывают на дно специального ведерка, на нее помещают чашки Петри с посевами — одну на другую, вверх дном. Поверх чашек под крышку ведерка закладывают вторую половинку чашки с поглощающей смесью. Все пространство ведерка заполняют чашками с посевами или подходящими по размеру кружками из дерева или резины. После заполнения ведерко опускают в аппарат, который закрывают крышкой, завинчивают винт и закрепляют крышку. Аппарат ставят в термостат. Карбонат натрия можно употреблять повторно до 30 раз, гипосульфит следует менять при каждом употреблении аппарата;

в) биологический — применение аэробных микробов, энергично поглощающих кислород воздуха с анаэробами. Существует несколько вариантов биологических методов.

Наиболее часто применяют метод Фортнера: питательный агар наливают в чашку Петри и ее крышку. Можно разрезать агар, налитый в чашку Петри по диагонали узкой щелью. На одну из половинок или на поверхность агара в крышке засевают культуру аэробного микроорганизма, жадно поглощающего кислород (кишечную палочку, чудесную палочку), а на другую половину чашки или на поверхность агара в чашке высевают исследуемый материал. Чашку закрывают и замазывает парафином или пластилином. Аэробные бактерии быстро используют кислород в герметически закрытой чашке, а потом начинают размножаться анаэробы. Через 24–48 ч чашку открывают и выделяют колонии для получения чистой культуры.

7.4. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Провести выделение чистых культур микроорганизмов методом Дригальского.

Задание 2. Провести выделение чистой бактериальной культуры спорообразующих микроорганизмов.

Задание 3. Выделить чистую микробную культуру анаэробных видов микробов.

7.5. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

2. Что такое колония микробов?

3. Какая бактериальная культура называется чистой, смешанной, загрязненной?

4. Какие существуют механические методы выделения чистой бактериальной культуры?

5. Какова особенность физического метода выделения ЧБК?

6. В чем сущность химического метода выделения ЧБК?

7. Что такое биопроба?

8. В чем особенность выделения ЧБК спорообразующих микроорганизмов?

9. Какие вы знаете методы посевов штрихом в чашке для получения изолированных колоний?

10. Какие существуют методы создания условий анаэробиоза?

11. Как осуществляется биологический метод выделения ЧБК анаэробных форм бактерий?

Тема 8. Биохимические свойства микроорганизмов

8.1. Цель занятия

Изучить биохимическую дифференциацию микроорганизмов. Установить различие между эшерихиями и сальмонеллами на средах с углеводами и многоатомными спиртами (цветной ряд, среда Эндо). Провести химическое и микроскопическое исследования культуры и изучить основных представителей процесса аммонификации.

8.2. Оборудование и материалы

Культуры аммонифицирующих микроорганизмов на МПБ и МПА (Bac. mycoides, Bac. mesentericus, Bac. subtilis, фуксин Пфейффера, предметные и покровные стекла, микроскопы, горелки, спички, посевы культур E. colli, S. dublin на МПБ и МПА, а также на средах с углеводами и многоатомными спиртами (лактоза, сахароза, глюкоза, маннит, дульцит и др.), посев этих культур на среде Эндо в чашках Петри, кедровое масло. Таблицы: биохимическая дифференциация энтеробактерий — микробов кишечно-сальмонеллезной группы, аммонифицирующие микроорганизмы. Мультимедийное устройство и презентация по теме.

8.3. Теоретический материал

Жизненные процессы микроорганизмов тесно связаны с деятельностью ферментов. Каждому виду микробов свойственны определенные ферменты, что позволяет дифференцировать их с учетом других признаков и свойств.

8.3.1. Сахаралитические свойства микробов

Ферменты, образуемые микробами, обладают способностью расщеплять сахар (углеводы и многоатомные спирты) на альдегиды и кислоты. Конечные продукты ферментации — диоксид углерода (СО₂) и водород. Разные ферменты неодинаково реагируют с одними и теми же сахарами. Это их свойство используется при биохимической дифференциации микроорганизмов.

Сахаралитические свойства микробов выявляют на средах с сахарами (средах Гисса), которые представляют собой смесь сахара и индикатора в пептонной воде. Из сахаров используют лактозу, сахарозу, глюкозу, мальтозу, арабинозу, маннит, дульцит и др. В качестве индикаторов применяют нейтральный красный лакмус, фуксин основной и т. д. Среды могут быть жидкими, тогда для улавливания газа на дно пробирки опускают «газовки» — маленькие пробирки, перевернутые (направленные) закрытым концом вверх. Образовавшийся в процессе ферментации газ вытесняет часть среды и скапливается в верхней части «газовки».

В полужидких средах с углеводами и индикатором ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты) могут наблюдаться разрыв столбика агара и скопление мелких пузырьков в толще среды и на ее поверхности, а также изменение цвета. При нейтральной реакции индикатор не изменяется (бесцветный), в кислой среде он принимает синий цвет, в щелочной — красный. В такой же цвет окрашивается и агар. Чистые культуры высевают на такие среды и выдерживают в термостате при определенной температуре (для патогенных –37 °С, для сапрофитов — 25–30 °С).

К биохимической дифференциации прибегают обычно в том случае, если микроорганизмы имеют много общих признаков: трудно различимый рост на питательных средах; клетки, морфологически похожие друг на друга, и т. д. Такое сходство наблюдается среди эшерихий и сальмонелл.

При их дифференциации кроме сбраживания сахаров учитывают способность свертывать молоко, образовывать газы и другие свойства.

В молоке содержится лактоза, которую сбраживает кишечная палочка. В результате образуется кислота, обуславливающая свертывание продукта. При высеве на молоко возбудителя сальмонеллеза кислота не продуцируется.

Биохимическую дифференциацию осуществляют и на среде Эндо. Среду (в сухом виде) готовят по следующей прописи: 5 г порошка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, нагревают при помешивании до кипения и через 2–3 мин разливают в чашки. Можно также расплавить мясопептонный агар, добавляя к нему 1%-ную растворенную и прокипяченную в дистиллированной воде лактозу и индикатор (1 мл спиртового раствора фуксина, обесцвеченного 10%-ным свежим раствором сульфита натрия).

При обесцвечивании основного фуксина раствором сульфита натрия образуется бесцветная фуксиносернистая кислота. Среду смешивают, разливают по чашкам и предохраняют от действия света. При сбраживании микробами лактозы образуется кислота, восстанавливается фуксин, который окрашивает колонии в красный цвет. Кишечная палочка (эшерихий) на среде Эндо продуцирует красные колонии с металлическим оттенком. Цвет колоний сальмонеллезных бактерий не изменяется, ибо они не сбраживают лактозу.

8.3.2. Протеолитические свойства микробов

Определение аммиака. Аммиак (продукта гнилостного распада белков) выявляют по изменению красной лакмусовой бумаги, которая в присутствии этого вещества синеет вследствие взаимодействия аммиака с водой и образования щелочи. В среде аммиак можно также установить с помощью реактива Несслера. Для этого в фарфоровую чашку пипеткой вносят каплю культуры аммонификаторов, выращенной на мясопептонном бульоне, и такое же количество реактива Несслера. При наличии аммиака смесь окрашивается в желтый или коричневый цвет (в зависимости от количества). Коричневое окрашивание указывает на большое содержание продукта гнилостного распада.

Определение сероводорода. Сероводород (конечный продукт серосодержащих аминокислот — цистина, цистеина, метионина) можно обнаружить с помощью полоски фильтровальной бумаги, размером 10 × 15 см, обработанной раствором уксуснокислого свинца и подвешенной над культурой исследуемых микробов. При содержании сероводорода бумага чернеет. Сероводород превращает уксуснокислый свинец в сернокислый. Сероводород на белковых средах образует аммонификаторы и другие организмы.

Определение индола. Индол (продукта превращения аминокислоты триптофана) выявляют на среде без углеводов, особенно глюкозы, которая препятствует его образованию. Индолообразование — один из признаков при определении вида микробов, поэтому его используют при их дифференциации. Существует несколько методов определения индола (Эрлиха, Сальковского, Строгова и др.), но наиболее простой и доступный из них — метод Морелли. Определение по этому методу проводят с помощью полоски фильтровальной бумаги, смоченной горячим насыщенным (12%) водным раствором щавелевой кислоты и высушенной в термостате. Бумагу подвешивают так же, как и при определении продуктов аммонификации. Культуру выращивают трое суток в термостате, затем определяют результаты взаимодействия продуктов жизнедеятельности микробов и щавелевой кислоты. Порозовение нижней части индикаторной бумаги указывает на наличие индола.

Определение каталазы. Фермент каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Для ее определения на предметное стекло наносят каплю 2–3%-ного раствора перекиси водорода и такое же количество микробной культуры. При наличии у данного вида микробов каталазы выделяются пузырьки газа (кислород).

8.3.3. Гемолитические свойства микробов

Некоторые виды бактерий в процессе жизнедеятельности вырабатывают особые вещества, обладающие лизирующим (растворяющим) действием на эритроциты. Эти вещества белковой природы называются гемотоксинами. Для определения гемолитической способности производят посев на питательные среды, содержащие 5% дефибринированной крови (чаще используют кровяной МПА). При росте на кровяной среде микроорганизмов, обладающих гемолитическими свойствами, вокруг колоний в результате лизиса эритроцитов образуется прозрачная зона (бесцветная или окрашенная). В жидких питательных средах при гемолизе среда с кровью обесцвечивается и становится прозрачной (красно-лаковая кровь).

8.3.4. Редуцирующие свойства микробов

Их выявляют на искусственных и естественных средах (МПБ, МПА, молоке и др.), содержащих индикаторы (органические красители). Микробы, образующие ферменты оксидазы и дегидразы, окисляют одни органические вещества и восстанавливают (редуцируют) другие. Одновременно с восстановлением происходит их обесцвечивание, в результате чего среда принимает прежнюю окраску.

Молоко с метиленовым голубым. К 100 мл хорошо обезжиренного и профильтрованного молока (рН 7,2) добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора метиленового голубого, после чего молоко приобретает интенсивно-голубой цвет. Среду стерилизуют текучим паром дробно. При редукции метиленового голубого молоко обесцвечивается и приобретает кремовый или белый цвет. Редуцирующие свойства микробов можно также определять на лакмусовом молоке, среде Омелянского, Ротбергера и др.

Редукция нитратов (денитрификация) — это способность микробов восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты), а затем в аммиак и свободный азот. Редукцию нитратов определяют посевом на специальную среду: к МПБ добавляют 2%-ный азотнокислый калий (калийную селитру), свободный от нитритов, затем засеивают культуру исследуемых микробов и через 48–72 ч культивирования в термостате при 37–38 °С добавляют 1 мл реактива, содержащего йодистый калий, и 10%-ный Н₂О₄ в определенных пропорциях. При редукции нитратов в нитриты появляется темно-синие окрашивание среды.

8.4. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с тестами, характеризующими ферментативные свойства бактерий (ферментация углеводов в средах Гисса, образование индола, сероводорода; тесты на каталазу).

Задание 2. Используя карточки с описанием свойств бактериальной культуры, с помощью определителя микробов установить её видовую принадлежность.

8.5. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие существуют методы определения сахаролитических свойств микроорганизмов?

2. Как проводят определение протеолитических свойств микроорганизмов (индола, сероводорода, аммиака)?

3. Как осуществляется определение гемолитических свойств микроорганизмов?

4. Как определяют редуцирующие свойства микробов?

Тема 9. Антибиотики. Методы определения антибиотиков в материале и антибиотикорезистентности бактерий

9.1. Цель занятия

Ознакомить студентов с методами определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

9.2. Оборудование и материалы

Стерильные чашки Петри с МПА, пробирки с чистой культурой стафилококка и кишечной палочки, стерильные градуированные пипетки на 2 мл, пинцеты, резиновые груши, набор стандартных дисков с антибиотиками, линейки. Мультимедийное устройство и презентация по теме.

9.3. Теоретический материал

Антибиотики — (греч. аnti — против и biosis — жизнь) — химические вещества биологического происхождения и их полусинтетические производные, избирательно тормозящие рост и размножение или убивающие микроорганизмы, простейшие, грибы, а также задерживающие рост злокачественных опухолей.

Первый отечественный пенициллин (крустозин) был получен З. В. Ермольевой из Penicillium сrustosum в 1942 г. Безусловно, без предшествующих многолетних исследований, в том числе и отечественных ученых, эта «случайность» вряд ли могла стать плодотворной. Более того, в 1985 г. в архивах Лионского университета была найдена диссертация рано скончавшегося студента-медика, за сорок лет до А. Флеминга подробно характеризующая открытый им препарат из плесени P. notatum, активный против многих патогенных бактерий.

Биологическая активность антибиотиков оценивается в международных единицах, которые содержаться в 1 мл раствора или в 1 мг препарата (ЕД/мл, ЕД/мг). За 1 ЕД антибиотика принимают наименьшее его количество в мкг, которое угнетает рост эталонного штамма микроорганизма в определенном объеме. Активность товарных антибиотиков чаще всего выражают в микрограммах активного вещества, содержащегося в 1 мг препарата. Для бензилпенициллина 1 ЕД равна 0,5988 мкг химически чистой натриевой соли препарата.

9.3.1. Виды антибиотиков

В соответствии с типом продуцента выделяют антибиотики, синтезируемые а) грибами: (бензилпенициллин, гризеофульвин, цефалоспорины); б) актиномицетами (аминогликозиды — стрептомицин, мономицин, тетрациклины, левомицетин и др.); в) бактериями (полимиксины (B. polymyxa), бацитрацин, лихенгиформин (B. licheniformis), грамицидин С (B. brevis), субтилин (B. subtilis), продигиозин (Serratia marcescens), колиформин (E. coli) и др. г) растениями: хлоремен (хлорелла), рафпанин (редис), амицин (чеснок), аренарин (бессмертник), иманин, новоиманин (зверобой), хинин (кора хинного дерева), хлорофиллипт (листья эвкалипта), гордецин (зерна ячменя), и др. д) животными: эритрин, лизоцим, интерфероны.

По антимикробной активности различают противогрибковые и антипротозойные антибиотики; по типу действия — бактерицидные, вызывающие гибель чувствительных к ним микроорганизмов ((пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, рифампицин, полимиксины и др.) и бактериостатические, затормаживающие рост и размножение микробов (тетрациклины, линкомицин, хлорамфеникол и др.). По спектру действия различают антибиотики: а) действующие на грамположительные микроорганизмы (цефалоспорины 1-го поколения, линкозамиды, биосинтетические пенициллины, ванкомицин, линкомицин, макролиды); б) действующие на грамотрицательные микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды, цефалоспорины 3-го поколения); в) широкого спектра действия (левомицетин, тетрациклины, аминогликозиды, полусинтетические пенициллины широкого спектра действия (ампициллин, азлоциллин и др.) и цефалоспорины 2-го поколения); а также г) противотуберкулезные антибиотики (стрептомицин, рифампицин, флоримицин); д) противогрибковые антибиотики (гризеофульвин, нистатин, леворин, фотерицин В, кетоконазол, дифлюкан и др.).

Выделяют антибиотики короткого и пролонгированного действия. Для поддержания бактерицидной концентрации в плазме пенициллин следует вводить каждые 4 ч, а роцефин (цефалоспорин 3-го поколения) — 1 раз в сутки.

По токсичности разделяют гепато-, нефро-, нейротоксичные и т. д. Выделяют антибиотики со строго регламентированной дозой применения (линкозамины, аминогликозиды и пр.) и препараты, дозу которых можно увеличивать в зависимости от выраженности инфекционного процесса (пенициллины, цефалоспорины).

По химическому строению антибиотики делят на 1) b-лактамные антибиотики. К ним относятся: а) пенициллины, среди которых выделяют природные (аминипенициллин) и полусинтетические (оксациллин); б) цефалоспорины (цепорин, цефазолин, цефотаксим); в) монобактамы (примбактам); г) карбапенемы (имипинем, меропинем, эртапенем); 2) аминогликозиды (неомицин, канамицин); 3) тетрациклины (тетрациклин, метациклин); 4) макролиды (эритромицин, мидекамицин, азитромицин); 5) полиены (амфотерицин, нистатин); 6) гликопептиды (ванкомицин, тейкоплакин); 7) оксазолидиноны (линезолид); 8) линкозамины (линкомицин, клиндамицин).

По механизму действия антибиотики делят на ингибиторы синтеза клеточной стенки; белка на рибосомах; нуклеиновых кислот.

Однако при неграмотном применении антибиотики могут оказывать побочные эффекты:

• токсические реакции: поражение печени (рифампицин, тетрациклин, левомицетин), почек (линкомицин, аминогликозиды), нарушение функций костного мозга (анемия, лейко-, тромбоцитопения, вплоть до апластического криза) — поражение органов кроветворения; поражение центральной и периферической нервной системы; эндотоксикоз;

• дисбактериозы — после приема антибиотиков широкого спектра действия, подавляющих жизнь многих бактерий, в том числе непатогенных, что приводит к нарушению естественного микробиоценоза и колонизационной резистентности;

• аллергизирующее действие — астматический бронхит, ринит, конъюнктивит, анафилактический шок и др.;

• тератогенное действие на плод;

• иммунодепрессивные состояния — цитостатический эффект препаратов на иммунокомпетентные клетки (циклоспорин, левомицетин).

Критериями активности того или иного препарата являются:

• минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация (МИК — МПК) — наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост тест-культуры;

• минимальная бактерицидная концентрация (МБК) — наименьшая концентрация препарата, вызывающая бактерицидный эффект.

9.3.2. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Метод диффузии антибиотика в агар (метод бумажных дисков). Метод прост в выполнении, позволяет определить чувствительность одновременно к нескольким антибиотикам, не требует выделения чистой бактериальной культуры. Применяют агар фирмы «Дифко», или МПА, или агар на переваре Хоттингера (с содержанием 120–140 мг % аминного азота, рН 7,2–7,4). Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри по 20 мл (толщина слоя 4–5 мм) и досушивают в термостате. 1 мл исследуемой суточной культуры или смыв суточной агаровой культуры в 1 мл физиологического раствора (концентрация клеток 10⁹/мл) наносят на агар и стерильным шпателем распределяют по поверхности. Избыток жидкости удаляют стерильной пастеровской пипеткой. Чашки Петри подсушивают при комнатной температуре 30–40 мин. На поверхность этой среды стерильным пинцетом накладывают, плотно прижимая, диски с разными антибиотиками на равном расстоянии и на расстоянии 2 см от края чашки (не более 6 дисков на одной чашке Петри). Чашки с посевами и дисками в положении вверх дном оставляют в термостате при 37 °С на 18–20 час.

Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий. Вокруг диска с антибиотиком образуется зона задержки (отсутствия) роста. Диаметр зоны задержки роста микроорганизмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точностью 1 мм. Если зона задержки роста микробов вокруг диска отсутствует — микробы не чувствительны к данному антибиотику. Если она до 14 мм — малочувствительны; от 15 до 25 мм — хорошо чувствительны, более 25 мм — высоко чувствительны (рис. 9.1).

Рис. 9.1. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии антибиотика в агар

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует контролировать диски на эталонных штаммах микроорганизмов, используя три культуры из Американской коллекции типовых культур или из Национальной коллекции типовых культур в Англии: S. aureus (АТСС 25923, № СТС 6571), P. aeruginosa (АТСС 27853, № СТС 10662) и E. coli (АТСС 25922, № СТС 10418).

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом Е-тест проводится аналогично дискодиффузному методу. Отличие в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентрации антибиотика от максимальной к минимальной. Место пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста — значение минимальной подавляющей (ингибирующей) концентрации (МПК, МИК), (рис. 9.2). При сравнительной простоте использования метод позволяет определить МПК и МБК. Но в связи с высокой стоимостью Е-тестов чаще применяют метод диффузии антибиотика в агар.

Рис. 9.2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом Е-теста. МПК равна 1,0

Методы серийных разведений. Основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (например, от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл и т.д. до 0,5; 0,25 и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение 18–20 ч при температуре 37 ˚С проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост, принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в миллиграммах на литр (мг/л) или микрограммах на литр (мкг/мл).

Метод серийных разведений на жидкой питательной среде: для многих микроорганизмов используют МПБ или бульон на переваре Хоттингера, для патогенных грибов — среду Сабуро, для стрептококков в среду добавляют 1% глюкозы. Бульонные и агаровые культуры микроорганизмов предварительно разводят физиологическим раствором (концентрация клеток 5 10⁶/мл). Схема определения чувствительности микроорганизма к антибиотику в жидкой питательной среде представлена в таблице 9.1 и на рис. 9.3.

Таблица 9.1

Определение чувствительности микроорганизма к антибиотику (в жидкой питательной среде)

Компонент
Количество компонента (мл) в пробирке

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Питательная среда
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5

Основной раствор антибиотика

4,5 Последовательный перенос по 4,5 мл*, – начиная с 1-й пробирки

Культура микроорганизма

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

Перемешивают встряхиванием.
Инкубируют в термостате при 37 oС 18–20 ч

*Из 14-й пробирки убрать 4,5 мл.

Первая пробирка содержит 500 мкг/мл антибиотика, каждая последующая — в два раза меньше.

Учет результатов: МПК — наименьшее количество антибиотика, дающее визуально полную задержку роста (бульон прозрачный), на рис. 9.3 — 32 мкг/мл.

Минимальная ингибирующая концентрация

Рис. 9.3. Определение МПК (МИК) — метод серийных разведений

Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБцК) из последних прозрачных пробирок после предварительного встряхивания делают высевы на плотные питательные среды. МБцК — наименьшее количество антибиотика в пробирке, содержимое которой после инкубирования в течение 24–48 ч не дало роста бактерий.

Метод серийных разведений на плотной питательной среде. Сухой МПА растворяют в колбе и автоклавируют. Затем колбы с питательной средой помещают в водяную баню и выдерживают до достижения 48–50 °С. В них асептически вносят растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара (при необходимости термолабильные питательные добавки). Среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри (толщина слоя — 4–5 мм) и оставляют при комнатной температуре для застывания.

Все чашки Петри делят на секторы, каждый из которых засевают исследуемой культурой. Посев делают бактериологической петлей из микробной суспензии с концентрацией клеток 10⁶–10⁷ на 1 мл. Чашки помещают в термостат при 37 °С на 24 ч. За МПК препарата принимают наименьшую концентрацию антибиотика, при которой наблюдается полная задержка роста бактерий или наличие единичных колоний. Для контроля роста используют чашки Петри без антибиотиков. Если рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме контрольной, — исследуемые концентрации антибиотиков превышают МПК. Когда рост бактерий наблюдается на всех чашках — микроб устойчив ко всем концентрациям антибиотика.

Также применяются ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Они основаны на определении изменений ферментативной активности микроорганизмов под воздействием антибиотиков; на определении цвета редокс-индикаторов при изменении окислительно-восстановительного потенциала во время роста бактерий в питательной среде; на цитологичной оценке изменений морфологии бактериальных клеток под воздействием антибиотиков.

9.4. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Определить чувствительность культуры стафилококка к антибиотикам методом бумажных дисков.

Задание 2. Определить чувствительность культуры кишечной палочки к антибиотикам методом серийных разведений на жидкой питательной среде.

9.5. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Что такое антибиотики?

2. Как используют антибиотики в ветеринарии, в животноводстве?

3. Какие различают антибиотики в соответствии с их продуцентами?

4. Как классифицируют антибиотики в соответствии с их антимикробной активностью, по типу и по спектру действия, по токсичности?

5. Как классифицируют антибиотики по их химическому строению и по механизму действия?

6. Какие побочные действия на организм могут оказывать антибиотики?

7. Как осуществляется определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар?

8. Какова особенность определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений на жидкой питательной среде?

9. Как осуществляется определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений на плотной питательной среде?

10. Что принимают за минимальную подавляющую концентрацию антибиотика?

11. Как определяется бактериостатическая и бактерицидная дозы антибиотиков?

Раздел II. Инфекционные болезни животных. Микозы и микотоксикозы

Тема 10. Лабораторная диагностика стафилококкозов

10.1. Цель занятия

Ознакомиться с основными биологическими свойствами возбудителей стафилококковых инфекций, правилами взятия и пересылки патологического материала, с методами лабораторной диагностики и профилактики стафилококкозов.

10.2. Материалы и оборудование

Культуры Staphylococcus aureus и S. saprophyticus на МПА, МПБ, кровяном МПА. Тесты с положительными результатами плазмокоагулирования, фибринолитической способности, гемолитической и лецитиназной активности и гидролиза ДНК патогенных стафилококков. Наборы красок для окраски по Граму, Михину и Ольту. Биопрепараты. Мультимедийное устройство и презентация по теме.

10.3. Теоретический материал

Стафилококкозы — бактериальные инфекции, характеризующиеся гноеродными процессами, вызванными патогенными стафилококками.

Стафилококк обнаружен Р. Кохом (1878), выделен из гноя фурункула человека Л. Пастером (1880), обстоятельно изучен Ф. Розенбахом (1884).

Стафилококки подразделяются на 3 вида: S. аureus — патогенные; S. epidermidis — условно патогенные, постоянные обитатели кожи и слизистых оболочек; S. saprophyticus — непатогенные (род Staphylococcus семейство Micrococcaceae)

Патогенные стафилококки проявляются в виде абсцессов, фурункулов, карбункулов, флегмон, маститов, метритов, пневмонии, сепсиса. Могут вызывать пищевые отравления людей.

10.4. Лабораторная диагностика стафилококкозов

Лабораторная диагностика стафилококкозов основана на результатах бактериологического исследования, которое включает бактериоскопию, выделения чистой бактериальной культуры и биопробу.

Материал для исследования. Для прижизненной диагностики при стафилококкозах в лабораторию направляют раневой экссудат, гной; при маститах — пробы молока. Раневой экссудат, гной берут стерильным ватным тампоном с палочкой, вставляют в стерильную пробирку и упаковывают. Жидкий экссудат, не вскрытый абсцесс можно отсосать стерильной иглой со шприцем и слить в стерильную пробирку. При подозрении на сепсис в лабораторию направляют кровь. Для посмертной диагностики направляют кусочки пораженных тканей и органов, кровь.

Бактериоскопия препаратов из исходного материала. Стафилококки имеют шаровидную форму. Располагаются часто в виде неправильных бессистемных скоплений. В мазках из бульонных культур имеют вид микро- или диплококков, из агаровых культур — расположены в виде скоплений, напоминающих гроздь винограда, диаметр кокков — 0,5–1,5 мкм, грамположительны. На кровяном агаре образуют зону гемолиза (рис. 10.1, а, б), спор не образуют, особо патогенные штаммы могут формировать капсулу. Неподвижны.

Рис. 10.1. Staphylococcus aureus: а — чистая культура, окраска по Граму; б — колонии на кровяном агаре

Выделение и изучение культуральных свойств возбудителя. Стафилококки хорошо развиваются на обычных питательных средах с рН 7,2–7,4 при температуре 30–37 °С в аэробных и анаэробных условиях (факультативные анаэробы). При загрязнении материала посторонней микрофлорой используют селективные питательные среды: солевой МПА, МПБ с 8–10% хлорида натрия, желточно-солевой агар (ЖСА), 3,5%-ный МПА с добавлением 3 мл 0,1%-го раствора кристаллвиолета (патогенные стафилококки образуют колонии фиолетового или оранжевого цвета). На МПБ растут интенсивно, вызывают равномерное помутнение среды, образуют рыхлый осадок. Иногда при достаточной аэрации создают поверхностную пленку. На плотных средах стафилококки растут в виде выпуклых с ровными краями непрозрачных колоний правильной круглой формы, диаметром 2–7 мм (рис. 10.1, а). При комнатной температуре, широкой аэрации и рассеянном свете стафилококки вырабатывают золотистые, белые, лимонно-желтые и другие пигменты. Лучшая среда для выделения стафилококка — кровяной агар, где они вызывают гемолиз (рис. 10.1, б).

Биохимические свойства. Применяются для определения патогенности стафилококков. Стафилококки ферментируют многие углеводы. Штаммы, ферментирующие маннит, являются патогенными (но эта способность не стабильна!). Ферментацию маннита определяют путем посева его на МПБ, содержащий 0,5% маннита, индикатор Андраде плюс газовки (пробирки Уленгута для улавливания газа). После 1–2-суточной инкубации при температуре 37 °С среда с патогенным штаммом микроба краснеет, в газовках иногда скапливаются пузырьки газа.

Патогенные стафилококки обладают способностью коагулировать плазму крови. Плазмокоагулазную активность определяют в специальной реакции плазмокоагуляции (РПК). Коагулаза — фермент стафилококков, который коагулирует плазму крови. Петлю бактериальной массы исследуемой культуры, снятой с поверхности агаровой среды, смешивают с 0,5 мл плазмы крови кролика (человека), не разведенной или разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:4, инкубируют при 37 °С. Учет результата через 4 ч и 24 ч. Положительная реакция — образование сгустка.

Патогенные стафилококки продуцируют фибринолизин. Для выявления фибринолитической способности пробирки с положительными результатами плазмокоагулирования оставляют в термостате на несколько суток. При наличии фибринолизина коагулированная плазма разжижается.

Тест на гемолизин. Исследуемую культуру засевают на чашку Петри с 5%-ным кровяным агаром и инкубируют при 37 °С 24 ч. Лизис эритроцитов проявляется в виде светлой (бета-гемолиз) или полупрозрачной (альфа-гемолиз) зоны вокруг колоний (рис. 10.1). Гемолитическую активность можно определить путем посева исследуемой культуры в 1–5%-ный кровяной бульон, который после культивирования выделяющего гемолизин микроба становится прозрачным за счет лизиса эритроцитов.

Гемолититическая способность стафилококков бывает не всегда выраженной. Скрытую (потенциальную) способность стафилококков выявляют на 5%-ном кровяном МПА. По диаметру чашки Петри делают прямой полоской посев бета-гемолитического штамма стафилококка. Перпендикулярно этой полоске с двух сторон высевают по 4–5 испытуемых штаммов стафилококков. После суточного инкубирования в непосредственной близости к высеянному по диаметру бета-гемолитическому штамму стафилококка образуется зона гемолиза.

Стафилококки продуцируют лецитиназу. Для ее определения к расплавленному и остуженному до 50–60 °С МПА добавляют взбитые яичные желтки и тщательно перемешивают. После застывания делают посев испытуемой культуры. Лецитиноположительные штаммы стафилококка через 24–48 ч вокруг колоний образуют зону помутнения, окруженную радужным венчиком.

Тест на ДНК-азу. Исследуемую культуру засевают «штрихом» на питательную среду с ДНК и культивируют при 37 °С 24 ч. Затем на поверхность среды с бактериальной культурой наливают 1 н. раствор соляной кислоты. Положительный результат — при гидролизе ДНК вдоль «штриха» культуры видна светлая зона (питательная среда с ДНК: в расплавленный МПА добавляют 10%-ный раствор ДНК до конечной 0,2%-ной концентрации, перемешивают, автоклавируют при 120 °С 15 мин и разливают в чашки Петри).

Патогенные стафилококки растут на среде с кристаллвиолетом, не патогенные не растут

Биопроба. Патогенные стафилококки вырабатывают энтеротоксин, который при попадании с пищей, с кормом в пищеварительный тракт вызывает пищевую токсикоинфекцию; летальный токсин общего действия; некротический токсин вызывает некроз тканей; гемотоксин обладает выраженным гемолитическим действием; лейкоцидин вызывает лизис лейкоцитов, гибель гематобластов костного мозга и нервных клеток. В стафилококковых культурах выделен также антикоагулянт, препятствующий свертыванию крови; гемагглютинины.

Стафилококковый экзотоксин, обезвреженный 0,3–0,5%-ным формалином при температуре 37 °С в течение 7–28 суток, при парентеральном введении людям и животным обусловливает синтез специфического антитоксина, способного вступать в реакцию с токсином.

Биопрепараты. Применяют преимущественно при хронических процессах, вызванных стафилококками (аутовакцина, антивирус-фильтрат).

10.5. Задания для самостоятельной работы

1. Приготовить мазки из представленных для исследований культур стафилококков, окрасить по Граму, промикроскопировать и зарисовать.

2. Описать культуральные свойства стафилококков.

3. Изучить биохимические свойства стафилококков.

4. Ознакомиться с представленными биопрепаратами.

10.6. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Кто впервые обнаружил, выделил и изучил стафилококки?

2. Какие различают основные виды стафилококков?

3. Какие патологические процессы вызывают в организме стафилококки?

4. Какой материал направляют в лабораторию для прижизненной и посмертной диагностики стафилококкозов?

5. Каковы морфологические, тинкториальные и культуральные свойства стафилококков?

6. По каким критериям дифференцируют патогенные и непатогенные стафилококки?

8. Какие токсины вырабатывают патогенные стафилококки?

9. Как проводится биопроба по определению энтеротоксина, летального, некротического токсина, гемотоксина и лейкоцидина?

Тема 11. Лабораторная диагностика стрептококкозов

11.1. Цель занятия

Ознакомиться с основными биологическими свойствами возбудителей стрептококковых инфекций, правилами взятия и пересылки патологического материала, с методами лабораторной диагностики и профилактики стрептококкозов.

11.2. Материалы и оборудование

Культуры Streptococcus pyogenes, S. agalactiae на глюкозо-сывороточном МПА, МПБ, средах Гисса с углеводами, стерильные МПА и кровяной МПА. Красители для окраски по Граму. Биопрепараты. Мультимедийное устройство и презентация по теме.

11.3. Теоретический материал

В патологии сельскохозяйственных животных наибольшее значение имеют следующие виды гноеродных стрептококков (род Streptococcus, семейство Streptococcaceae): а) Streptococcus agalactiae — возбудитель мастита коров; б) Streptococcus equi — возбудитель мыта лошадей; в) Streptococcus pneumoniaе — возбудитель стрептококковой (диплококковой) септицемии молодняка сельскохозяйственных животных: г) Streptococcus pyogenes — возбудители гнойно-некротических процессов.

Лабораторная диагностика стрептококкозов основана на результатах бактериоскопического исследования, выделения чистой бактериальной культуры, биохимических, серологических исследований и биопробы.

11.4. Материал для исследования

При подозрении на мастит коров исследуют паренхимное молоко; на мыт лошадей — прижизненно исследуют носовые истечения, содержимое абсцессов лимфатических узлов (пунктат), для посмертной диагностики — кровь из сердца, кусочки печени, легких, селезенки; на септические стрептококкозы — кровь из сердца, паренхиматозные органы, костный мозг.

Бактериоскопия препаратов из исходного материала. Препараты окрашивают по Граму и на капсулы. Стрептококки — грамположительные сферические или овальные клетки, диаметром 0,5–1,5 мкм, расположенные в цепочку различной длины, спор не образуют, неподвижные. Особо вирулентные штаммы создают капсулу.

11.5. Выделение и изучение культуральных свойств возбудителей стафилококкозов

Факультативные анаэробы. На обычных питательных средах растут слабо. Для культивирования используют обогащенные среды: МПА с 1% глюкозы и 5% крови барана или кролика; МПБ с 1% глюкозы и 10% инактивированной сыворотки крови лошади. Оптимальная температура роста — 37–38 °С (от 25 до 45 °С). Streptococcus agalactiae: в глюкозо-кровяном бульоне среда остается прозрачной, формирующиеся крупинки оседают на дно; на глюкозо-кровяном агаре — колонии мелкие, сероватые, просвечивающиеся с бета- или двойной зоной альфа-гемолиза. Streptococcus equi: в МПБ рост с помутнением среды и образованием хлопьевидного осадка. Через 3–5 суток культивирования бульон просветляется, на дне пробирки осаждается плотный осадок. На МПА колонии мелкие, росинчатые, слизистые, округлой формы с зоной бета-гемолиза (рис. 11.1, д), позднее становятся серо-белыми. Streptococcus pneumoniaе: в МПБ растет с равномерным помутнением среды; на МПА колонии круглые, полупрозрачные, плоские, с приподнятым центром и краями, с зоной альфа-гемолиза. Streptococcus pyogenes: в МПБ растет с просветлением среды и выпадением зернистого осадка; на МПА колонии мелкие, прозрачные, округлой формы, с зоной бета-гемолиза (рис. 11.1, д).

11.6. Биохимические свойства

Streptococcus agalactiae: не разжижает желатину, не редуцирует и не свертывает метиленовое молоко; ферментирует углеводы лактозу, сахарозу, глюкозу, мальтозу; не ферментирует сорбит и дульцит; вызывает гидролиз гиппурата натрия. Проявляют гемолиз в условиях САМР-пробы (на кровяной агар в чашках Петри бактериологической петлей по диаметру засевают в виде полоски гемолитический стафилококк. Отступив 2–3 см, перпендикулярно к стафилококку петлей высевают штаммы исследуемых стрептококков, помещают в термостат (37 °С) на 24 ч).

Во всех случаях выделения агалактийного стрептококка в пробах молока высокое содержание лейкоцитов, ослабление лизоцимной активности, положительная проба Уайтсайда (лейкоцитоз), положительная бромтимоловая проба на щелочность молока (рис. 11.1).

Вирулентность патогенных стрептококков обусловлена тем, что они вырабатывают токсины. Так, Streptococcus agalactiae продуцирует несколько токсинов: гемолитический, некротический, лейкоцидин, эритрогенный (обусловливает местную воспалительную реакцию тканей), вырабатывает ферменты фибринолизин и гиалуронидазу, усиливающие его патогенность.

Streptococcus equi: не свертывает молоко, не редуцирует лакмус и метиленовый синий, не сбраживает лактозу, сорбит, манит, что позволяет дифференцировать от других стрептококков; не растет в присутствии мытного антивируса (фильтрат 20-дневной бульонной культуры мытного стрептококка), в то время как все остальные виды стрептококков растут.

Streptococcus pneumoniaе: ферментирует углеводы лактозу, сахарозу, глюкозу, мальтозу, салицин, инулин; не разжижает желатину, не образует индол, свертывает молоко; растворяется в желчи. Отношение к желчи и разложению инулина имеет дифференцирующее значение по отношению к другим стрептококкам, некоторые штаммы образуют капсулу (рис. 11.1, г, е).

Рис. 11.1. Стрептококки: а — Streptococcus agalactiae в молоке; б — Streptococcus equi в гное; в — чистая культура Streptococcus pyogenes; г – Streptococcus pneumoniaе в патологическом материале; д — Streptococcus pyogenes, ß-гемолиз; е — Streptococcus pneumoniaе, образование капсул

Серологическая типизация выделенного стрептококка определяется в реакции кольцепреципитации с использованием преципитирующих групповых стрептококковых сывороток и суточной бульонной культуры.

Биопроба. Биопробу на стрептококкозы проводят на белых мышах с применением свежевыделенных штаммов 18–20-часовых бульонных культур. Культуру вводят трем мышам внутрибрюшинно по 0,5 мл. При гибели не менее двух мышей культуру признают патогенной.

В случае инфекции, вызванной Streptococcus pneumoniaе, проводят выделение возбудителя из исследуемого материала методом биопробы (тканевую суспензию, разведенную в стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:2, внутрибрюшинно вводят белым мышам. В положительных случаях мыши погибают через 1–2 суток).

Биопрепараты:

1) формолвакцина против диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят (из штаммов Streptococcus pneumoniaе, выделенных от этих видов животных);

2) ассоциированная поливалентная вакцина против паратифа, пастереллеза и диплококковой септицемии поросят (из Pasteurella multocida, Salmonella cholerasuis, Streptococcus pneumoniaе);

3) сыворотка против диплококковой септицемии телят ягнят и поросят (получают гипериммунизацией волов убитыми и живыми культурами Streptococcus pneumoniaе);

4) инактивированные вакцины из стрептококков серологической группы С.

11.7. Задания для самостоятельной работы

1. Приготовить мазки из культур стрептококков, окрасить по Граму, на капсулы, промикроскопировать, зарисовать.

2. Изучить морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства стрептококков.

3. Ознакомиться с биопрепаратами против диплококковой септицемии молодняка сельскохозяйственных животных.

11.8. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие стрептококки участвуют в патологии сельскохозяйственных животных (мастит коров, мыт лошадей, пневмония, диплококковая септицемия, гнойно-некротические процессы)?

2. Какой патологический материал направляют в лабораторию для диагностики патогенных стрептококкозов?

3. Каковы морфологические особенности патогенных стрептококков?

4. Каковы особенности культуральных свойств патогенных стрептококков?

5. Каковы особенности биохимической активности патогенных стрептококов?

6. Что представляет собой САМР-проба? В каких случаях ее применяют?

7. Какие углеводы расщепляют патогенные стрептококки?

8. Какие дополнительные исследования проводят при выделении агалактийного стрептококка?

9. Какие токсины продуцирует Streptococcus agalactiae?

10. Как осуществляется биопроба при патогенных стрептококкозах?

11. Какие исследования проводятся для дифференциации Streptococcus pneumoniaе от других видов стрептококков?

12. Какие существуют биопрепараты для профилактики и лечения диплококковой септицемии молодняка сельскохозяйственных животных.

Тема 12. Лабораторная диагностика туберкулеза

12.1. Цель занятия

Ознакомиться со свойствами возбудителей, методами лабораторной диагностики, биопрепаратами против туберкулеза.

12.2. Материалы и оборудование

Суспензия микобактерий (вакцина БЦЖ) в смеси с эшерихиями, стафилококками, красители для окраски по методу Циля — Нельсена, биопрепараты, гистопрепараты. Мультимедийное устройство, презентация по теме.

12.3. Теоретический материал

Туберкулез — хроническое инфекционное заболевание сельскохозяйственных и диких животных, птиц, а также человека, характеризующееся образованием в пораженных тканях и органах специфических бугорков (туберкулов), предрасположенных к творожистому распаду.

Возбудитель выделен в 1882 г. Р. Кохом.

Возбудители туберкулеза относятся к роду Mycobacterium, семейству Mycobacteriaceae. Различают следующие виды возбудителя туберкулеза: М. tuberculosis — возбудитель туберкулеза человека; М. bovis — возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота; М. avium — возбудитель туберкулеза птиц; M. murium — вид возбудителя туберкулеза мышей-полевок; — М. poykilothermorum вид возбудителя туберкулеза холоднокровных. В патологии животных и человека участвуют первые три вида возбудителей туберкулеза.

Морфология. Виды возбудителей туберкулеза отличаются по морфологическим и культуральным свойствам. M. tuberculosis — тонкая, нежная, слегка изогнутая палочка; M. bovis — толще и короче, чем M. tuberculosis; M. avium — короче по сравнению с M. tuberculosis и M. bovis и более полиморфна.

Размеры и формы микобактерий могут иногда варьировать, в зависимости от питательной среды, условий культивирования, возраста культуры.

В последние годы часто выделяют атипичные L-формы возбудителя туберкулеза. Это измененные формы, которые выделяют в виде мелких зерен, шаровидных тел. L-формы обладают способностью к реверсии (т.е. переходить в типичные, патогенные формы, вызывающие заболевания).

Микобактерии туберкулеза спор и капсул не образуют, неподвижны, аэробы. Высокая устойчивость микобактерий во внешней среде обусловлена тем, что они относятся к группе кислото-спирто-щелочеустойчивых, которые содержат в своем составе жировосковые вещества и миколовую кислоту (до 60%). В цитоплазме располагаются кислотолабильные гранулы, состоящие в основном из метафосфата (зерна Муха). Липиды и воскоподобные вещества придают микробной клетке гидрофобность, т. е. способность отталкивать воду и водные растворы красителей, кислот, щелочей, в связи с чем бактерии туберкулеза плохо воспринимают окраску.

Заражение происходит аэрогенным (воздушно-капельным и воздушно-пылевым), алиментарным (через рот) путем, через кожу и слизистые оболочки. Доказано внутриутробное инфицирование плода.

Лабораторная диагностика туберкулеза основана на результатах бактериологического, аллергического и серологического исследований.

Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале (методом световой и люминесцентной микроскопии и биопробой), выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по культурально-морфологическим, ферментативным и патогенным признакам.

Материал для исследования. Для прижизненной диагностики: истечения из носа, бронхиальная слизь, молоко, сперма, фекалии, моча.

Для посмертной диагностики: трупы птиц целиком (исследуют печень, селезенку, легкие, яичники). От крупных животных — кусочки пораженных тканей и органов с туберкулами, лимфатические узлы. Материал свежий, замороженный или в 30%-ном глицерине.

Обсемененность патологического материала микобактериями туберкулеза может быть незначительной, поэтому для получения достоверных диагностических результатов специальными методами обработки повышают концентрацию возбудителя. К обработке предъявляют ряд требований: она должна обеспечивать гомогенизацию материала, уничтожать сопутствующую микрофлору, быть щадящей для микобактерий туберкулеза и способствовать их концентрации в материале (обогащение). Обогащение проводят в зависимости от исследуемого материала:

• мокрота, слизь, гной — заливают равным объемом трехзамещенного фосфата натрия (на 24 ч в термостат). Центрифугируют при 3000 об/мин 10–15 мин. Исследуют осадок;

• пораженные ткани — готовят гомогенат, заливают 3–10%-ным расвором H₂SO₄ (1:4). Центрифугируют при 3000 об/мин 10–15 мин. Отмывают физиологическим раствором. Исследуют осадок;

• молоко — 150 мл. Центрифугируют при 3000 об/мин 20–30 мин. Осадок обрабатывают 3–6%-ным раствором H₂SO₄ 20–30 мин. Центрифугируют, исследуют осадок;

• масло — (2–4 г) в стерильную пробирку. Залить горячей водой, встряхивать 5–10 мин. Перевернуть, охладить. Исследовать жидкость, как молоко;

• фекалии — (50 г) растирают в 18%-ном растворе Н₂SО₄, фильтруют через марлю, центрифугируют. Исследуют осадок.

Для концентрации микобактерий в исследуемом материале применяют также метод флотации. В колбу с узким горлом вносят 10 мл гомогената и 10 мл 1%-го NaOH, шуттелируют 10 мин. Затем добавляют дистиллированную воду (1:9), 1–2 мл ксилола (бензина, петролейного эфира), шуттелируют 10 мин, а затем доливают до горлышка дистиллированную воду. Через 30 мин исследуют содержимое флотационного кольца.

Бактериоскопия препаратов из исходного материала. Из-за специфического состава микобактерии туберкулеза не окрашиваются обычными методами. Их окрашивают, используя метод Циля — Нельсена: добавляют карболовый фуксин (при подогревании), промывают водой, затем обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты (2 мин), снова промывают водой, проводят дополнительное обесцвечивание 70–90 градусным этиловым спиртом (3–5 с), докрашивают раствором метиленовой сини (или малахитовой зелени).

Микроскопическая картина: микобактерии окрашиваются в ярко-красный цвет, остальная микрофлора — в синий (или в зеленый) (рис. 12.1, а).

Рис. 12.1. M. Tuberculosis: а — окраска по Цилю — Нельсену; б — рост на жидкой питательной среде; в — серпантинообразные «косы» (корд-фактор); г — колонии на среде Левенштейна–Йенсена; д — свечение под люминесцентным микроскопом

При окрашивании по Граму применяют модифицированный метод Грамма — Муха: на фиксированный мазок наносят карболовый метилвиолет (красят при подогревании), затем на 1 мин вносят раствор Люголя и обесцвечивают 5%-ной азотной кислотой (либо 3%-ной соляной кислотой, либо смесью ацетона и спирта), затем докрашивают сафранином или разведенным фуксином.

Микроскопическая картина: микобактерии фиолетового цвета, остальные микроорганизмы — красного цвета (рис. 12.1).

Бактериоскопический метод позволяет выявить возбудителя при концентрации микобатерий (1–5) × 10⁵ в 1 мл. Более результативна люминесцентная микроскопия (окраска аурамин-родамином), благодаря которой выявляют даже незначительное количество микобактерий, которые окрашены в бело-желтый цвет, а также формы с измененными тинкториальными свойствами.

Выделение возбудителя и изучение его культуральных свойств. Возбудитель туберкулеза — строгий аэроб. Оптимальная температура для M. tuberculosis — 37–38 °C, M. bovis — 38–39 °C, M. avium — 39–41 °С. Оптимум рН-среды — 6,8–7,4.

Растут медленно. Для культивирования микобактерий туберкулеза используют сложные питательные среды, содержащие глицерин, картофель, яйца, витамины. Рост бактерий стимулируют глюкоза, альбумины, аспарагиновая кислота, никотиновая кислота, биотин, соли аммония и др. Их культивируют на средах Петраньяни, Гельберга, Левенштейна — Йенсена.

M. tuberculosis — на жидких средах к концу месяца образуется толстая морщинистая пленка (12.1, б). На плотных питательных средах — рост в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. У колоний приподнятый центр; они крошковидные, с приятным запахом, по виду напоминают цветную капусту, плохо смачиваются водой (рис. 12.1, г). На жидких средах при внутриклеточном развитии для M. tuberculosis возможно образование корд-фактора (трегалоза-6,6-дипилокат), характеризующегося сближением бактерий в микроколонии в виде «серпантинообразных кос» (рис. 12.1, в).

M. bovis — на жидких средах через 20–60 дней образуется пленка, вначале в виде единичных островков, которые затем сливаются в сплошную петлистую, бородавчатую пленку. На плотных средах колонии мелкие, гладкие, цвета слоновой кости, иногда с морщинистым сероватым налетом.

M. avium — на жидких средах через 10–20 дней сначала образуется тонкая, нежная пленка, которая затем становится слегка морщинистой, влажной, жирной, образуется небольшой рыхлый осадок. На плотных яичных средах колонии округлые, мягкие, маслянистые, серовато-белого цвета, с возрастом желтеют, иногда образуют возвышение с кратерообразным углублением.

Биохимические свойства возбудителей туберкулеза, имеющие дифференциально-диагностическое значение, представлены в таблице 12.1.

Mycobacterium tuberculosis патогенны для человека, крупного рогатого скота, свиней, собак, кошек. Из лабораторных животных восприимчивы кролики, морские свинки.

Mycobacterium bovis — патогенны для крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, кошек, собак, оленей, маралов и др. Из лабораторных животных восприимчивы кролики, морские свинки. Восприимчив человек.

Таблица 12.1

Биохимические признаки микобактерий

Активность | М. tuberculosis | М. bovis | М. avium
Синтез уреазы | + | + | –
Редукция нитратов | + | – | –
Синтез каталазы | – | – | +/–*
Аккумуляция ниацина | + | – | –
Гидролиз твина (10 сут) | +/– | – | –

* (+/–) — признак варьирует.

Mycobacterium avium — вызывает туберкулез кур, индеек, цесарок, фазанов, павлинов, голубей, уток и других птиц. Также к нему восприимчивы свиньи, лошади, козы, овцы и иногда крупный рогатый скот и человек. Из лабораторных животных чувствительны кролики. Для биопробы от птиц используют кур.

Биопроба. Метод применяют для обнаружения возбудителя в исследуемом материале (рис. 12.2) и для определения его видовой принадлежности.

Заражают двух морских свинок — по 1–2 мл суспензии материала подкожно в область паха; двух кроликов — внутривенно; двух кур — внутривенно (морских свинок и кур после туберкулинизации!). Наблюдают 3 месяца.

При положительном результате у морских свинок через 2–3 недели увеличиваются регионарные лимфоузлы, на месте инъекции образуется уплотнение, затем язва. Через 30 дней морскую свинку тубекулинизируют.

В случае положительной реакции подвергают убою и бактериологическому исследованию. После обнаружения в мазках микобактерий дают положительное заключение и дальнейшее биологическое исследование прекращают.

Рис. 12.2. Биопроба на туберкулез

Вид микобактерий устанавливают, основываясь на результатах биопробы (табл. 12.2).

Таблица 12.2

Патогенность микобактерий туберкулеза для лабораторных животных

Вид микобактерий | Морская свинка | Кролик | Куры
М. bovis | Генерализованный туберкулез | Генерализованный туберкулез | Непатогенен
М. tuberculosis | Генерализованный туберкулез | Локальное поражение органов | Непатогенен
М. avium | Непатогенен | Сепсис | Генерализованный туберкулез

Серологическая диагностика в ветеринарии не имеет широкого применения. РСК рекомендован как дополнительный метод для диагностического убоя животных, положительно реагирующих на туберкулин.

Аллергическая диагностика не принадлежит к лабораторным методам, но является основным методом прижизненной диагностики туберкулеза у животных и птиц (рис. 12.3). Применяют сухой очищенный туберкулин (протеин-пурифиед-дериват, ППД), который вводят крупному рогатому скоту, оленям, верблюдам, буйволам внутрикожно в области средней трети шеи, свиньям — на каудальную поверхность уха, курам — в толщу одной бородки. У крупного рогатого скота (оленей, верблюдов, буйволов) реакцию учитывают через 72 ч, измеряя толщину кожной складки с учетом припухлости.

Рис. 12.3. Положительная внутрикожная реакция на туберкулин: а — крупный рогатый скот; б — свиньи; в — куры

Положительной реакцией считается болезненный отек кожи, размером более 35 × 45 мм, теплый на ощупь. Кожная складка увеличивается более чем на 3 мм. Измерение толщины кожной складки проводят кутиметром.

У свиней учет реакции через 48 ч — большая болезненная припухлость на месте инъекции туберкулина. У кур реакцию учитывают через 30–36 ч — при положительной реакции бородка горячая, опухает и отвисает.

Крупным животным проводится внутриглазная туберкулиновая проба. Туберкулин (3–4 капли) вводится в область внутреннего угла глаза, двукратно с интервалом 5–6 дней. Учет реакции после первого введения через 6 ч, 9, 12 и 24 ч, после второго — через 3 ч, 4, 6 и 12 ч.

Положительная реакция — гнойный кератоконъюктивит (рис. 12.4).

Аллергическая диагностика позволяет поставить диагноз в начальной стадии развития болезни. При положительной повторной аллергической реакции животных сдают на спецубой на мясокомбинат.

Для дифференциации неспецифической реакции у крупного рогатого скота проводят симультанную аллергическую пробу (одновременно с туберкулином для млекопитающих проводится туберкулинизация комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КАМ).

При развитии туберкулезного процесса в местах размножения возбудителя образуется защитный очаг — туберкул. Основу туберкула составляют фагоциты, формирующие узелок. Узелок окружается соединительнотканной капсулой. Ткань внутри узелка из-за отсутствия притока питательных веществ и под действием токсинов возбудителя отмирает и превращается в творожистую массу. Исход первичного туберкулезного процесса может быть различным.

Рис. 12.4. Положительная внутриглазная проба на туберкулин: а — крупный рогатый скот; б — коза; в — верблюд

Инкапсулированные первичные очаги часто обызвествляются и вместе с туберкулезными палочками сохраняются в организме длительное время. При пониженной резистентности организма процесс инкапсуляции в первичном очаге выражен слабо, регенерация соединительной ткани недостаточна, это приводит к расплавлению стенок туберкулезного узелка. Микобактерии попадают в здоровую ткань, что приводит к появлению множества мелких узелков, которые, сливаясь между собой, образуют крупные туберкулезные фокусы. Отсюда микобактерии могут попасть в кровь и способствовать развитию туберкулезных очагов в разных органах (рис. 12.5).

Рис. 12.5. Туберкулы в пораженных органах: а — надвыменный лимфатический узел коровы; б — печень птицы; в — трубчатая кость человека; г – легкие коровы; д –лимфатический узел быка; е — кишечник коровы; ж — матка коровы; з — почки овцы; к — легкие (зоны казеозного распада в центе и пограничного воспаления с гигантской клеткой Пирогова — Лангханса, клеточной инфильтрацией и разростом соединительной ткани)

Биопрепараты:

1) вакцина ВЦЖ (ВСG) — Bacillus Calmette — Guerin, в 1924 г. создали Кальмет и Герен, во Франция, путем 230 пересевов (на картофельно-глицериновой среде с добавлением бычьей желчи, в течение 18 лет культивирования вирулентного шт. М.bovis). Применяют в медицине;

2) ППД-туберкулин для аллергической диагностики туберкулеза у млекопитающих (ППД-протеин пурифиед дериват); ППД-туберкулин для птиц; для аллергической диагностики туберкулеза у свиней — одновременно вводят ППД-туберкулин для млекопитающих и ППД-туберкулин для птиц;

3) сухой очищенный комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ) готовят по типу ППД-туберкулина (ВГНКИ) для симультанной пробы КАМ в качестве дополнительного метода диагностики в благополучных по туберкулезу хозяйствах.

12.4. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с морфологическими, культуральными, биохимическими, тинкториальными свойствами возбудителей туберкулеза.

Задание 2. Изучить особенности биопробы на туберкулез, аллергическую диагностику и методы профилактики туберкулеза

12.5. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Кто первым открыл возбудитель туберкулеза? В каком году?

2. Какие различают виды возбудителей туберкулеза?

3. По каким морфологическим признакам отличаются разные виды возбудителей туберкулеза?

4. Каковы особенности культуральных свойств разных видов микобактерий?

5. Какие методы диагностики применяются при туберкулезе?

6. Какая основная ранняя прижизненная диагностика туберкулеза?

7. По каким биохимическим свойствам дифференцируют разные виды микобактерий туберкулеза?

8. Чем обуславливается высокая устойчивость возбудителя туберкулеза во внешней среде?

9. Что понимают под L-формой возбудителя туберкулеза?

10. Дайте характеристику вакцине БЦЖ.

11. Какие биопрепараты применяются для диагностики туберкулеза?

Тема 13. Лабораторная диагностика рожи свиней

13.1. Цель занятия

Ознакомиться со свойствами возбудителя рожи свиней и методами лабораторной диагностики.

13.2. Материалы и оборудование

Трупы мышей (голубей), павших после заражения вакцинным штаммом возбудителя рожи свиней; набор инструментов для вскрытия животных; скошенный МПА, МПБ, МПЖ в пробирках; пастеровские пипетки; культуры возбудителя рожи свиней на средах Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, в МПБ с индикаторной бумажкой на сероводород; биопрепараты. Мультимедийное устройство, презентация по теме.

13.3. Теоретический материал

Рожа свиней — зооантропонозная инфекционная болезнь. Болеют поросята в возрасте от 3 мес. до года. Единичные случаи встречаются у ягнят, пушных зверей, крупного рогатого скота, грызунов, птиц; восприимчив человек. Болезнь протекает остро и хронически. Острое течение характеризуется признаками септицемии, воспалительной эритемой. При острой форме на коже животных появляются красные пятна, которые исчезают при надавливании (рис. 13.1). Хроническая форма характеризуется эндокардитами и артритами.

Возбудитель рожи свиней — бактерия Erysipelothrix rhusiopathiae, род Erysipelothrix. Открыт в 1882 г. Л. Пастером и Л. Тюилье.

Рис. 13.1. Клиническое проявление острой формы рожи свиней (крапивница)

Материал для исследования. В лабораторию направляют труп животного целиком или паренхиматозные органы (печень, селезенку, почку, сердце), трубчатую кость, при хроническом течении — обязательно сердце. Материал посылают свежим или консервируют в стерильном 30%-ном растворе глицерина.

Бактериоскопия препаратов из исходного материала. Мазки-отпечатки из органов окрашивают по Граму и методом флюоресцирующих антител. Возбудители рожи — мелкие грамположительные палочки, располагаются одиночно, попарно или в виде небольших скоплений. Спор и капсул не образуют, неподвижны, размером (0,2–0,3) × × (0,8–2,5) мкм. При хроническом течении в препаратах из пораженных клапанов сердца обнаруживают в форме нитей, целых клубочков (рис. 13.2). При обработке препаратов флюоресцирующей сывороткой обнаруживают светящиеся клетки бактерий.

Выделение чистой культуры и изучение культуральных свойств возбудителяя. Посевы проводят на МПА, в МПБ или бульон Хоттингера. Erysipelothrix rhusiopathiae — факультативный анаэроб, микроаэрофил. Температурный оптимум — 36–37 °С, рН — 7,2–7,5.

Рис. 13.2. Erysipelothrix rhusiopathiae: а — в препарате из патологического материала при острой форме; б — образование нитей на клапанах сердца при хронической форме течения болезни

В МПБ возбудитель растет в виде едва заметного, видного только в проходящем свете, незначительного помутнения среды, которая через 48–72 ч просветляется. На дне пробирки образуется небольшой осадок, при встряхивании поднимающийся в виде нежного облачка. На плотных средах образует мелкие, гладкие, росинчатые колонии с голубоватым оттенком. При хронической форме колонии крупные, шероховатые. Посевы на плотных средах лучше изучать с помощью лупы.

Биохимические свойства. Возбудитель рожи расщепляет с образованием кислоты без газа глюкозу, лактозу, мальтозу и галактозу. Не ферментирует маннит, сахарозу, дульцит, эскулин, рамнозу; образует сероводород; не продуцирует каталазу и индол; не растет в МПБ с 8,5% хлорида натрия. Особо патогенные штаммы вырабатывают гиалуронидазу.

Серологическая идентификация. Вид Erysipelothrix rhusiopathiae содержит 22 серовара. Их обозначают цифрами. Чаще выделяются 1-й и 2-й серовары (ранее обозначали А и В). Видовую серологическую идентификацию проводят с противорожистой лечебно-профилактической сывороткой. На предметное стекло наносят каплю иммунной противорожистой сыворотки (предварительно разведенной в физиологическом растворе 1:50) и в ней бактериологической петлей тщательно суспендируют выделенную суточную агаровую культуру. Положительная реакция — агглютинация с образованием мелких плотных комочков.

Биопроба. Патматериал измельчают в ступке со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:10. Экссудат вводят подкожно белым мышам массой 16–20 г, по 0,1–0,2 мл. При положительном результате животные через 2–4 сут после заражения погибают. В более поздние сроки погибают животные, зараженные суспензией из материала от свиней — хроников или слабовирулентными культурами. При бактериологическом исследовании материала из трупов мышей выделяют возбудителя рожи.

Бактериологический диагноз на рожу свиней считают установленным при обнаружении возбудителя в исследуемом материале или в смешанной культуре (без выделения чистой культуры) методом флуоресцирующих антител (МФА); выделении культуры с характерными для возбудителя свойствами на питательных средах из патологического материала; в случае гибели лабораторных животных и выделения из органов культуры возбудителя рожи (даже если он не выделен в посевах из исходного материала).

13.4. Биопрепараты

Перечислим виды биопрепаратов:

1. Концентрированная гидроокисьалюминиевая формолвакцина против рожи свиней. Содержит культуры возбудителя серовара В. Свиней вакцинируют двукратно, с интервалом 12–14 дней. Вакцину вводят внутримышечно в области бедра или на границе средней и верхней трети шеи.

2. Депонированная вакцина против рожи свиней — представляет собой живую культуру матрикса Конева, сорбированную на гидроокиси алюминия. Вакцинацию проводят двукратно с интервалом между первым и вторым введением 12–14 дней. Вакцину вводят подкожно с внутренней стороны бедра или в области шеи (за ухом): первый раз — с одной стороны, а второй раз — с другой. Доза вакцины для первой вакцинации — 0,3 мл и для второй — 0,5 мл. Иммунитет после первой вакцинации наступает на 7–10-й день. После двукратной вакцинации иммунитет сохраняется не меньше 6 месяцев.

3. Сухая живая вакцина против рожи свиней ВГНКИ из штамма ВР-2 представляет собой лиофильно высушенную культуру. Вакцину вводят внутримышечно в область бедра или на границе средней и верхней трети шеи:

а) свиней в возрасте 2–4 месяцев прививают в дозе 0,5 мл. Первую ревакцинацию проводят через 25–35 дней в дозе 1 мл, а последующую — через 4–5 месяцев в дозе 1 мл;

б) свиней старше 4 месяцев прививают вакциной в дозе 1 мл, ревакцинируют через 4–5 месяцев в дозе 1 мл;

в) свиней, отправляемых в другие хозяйства железнодорожным транспортом, прививают в дозе 1 мл однократно не позднее чем за 20–30 дней до отправки независимо от сроков предыдущей прививки.

4. Лечебно-профилактическая сыворотка против рожи свиней (получают путем гипериммунизации свиней культурой возбудителя рожи.

5. Сухая рожистая флуоресцирующая (люминесцирующая) сыворотка для прямого метода иммунофлуоресценции (серологическая идентификация возбудителя).

13.5. Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить мазки из культуры вакцинного штамма возбудителя рожи свиней, окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать

Задание 2. Изучить морфологические, культуральные и биохимические свойства возбудителя рожи свиней.

Задание 3. Провести видовую серологическую идентификацию вакцинного штамма Erysipelothrix rhusiopathiae с противорожистой сывороткой.

Задание 4. Ознакомиться с биопрепаратами для специфической профилактики и диагностики рожи свиней.

13.6. Вопросы для самоконтроля знаний

1. Дайте название возбудителя рожи свиней в латинской транскрипции?

2. Как характеризуется острое и хроническое течение рожи свиней?

3. Кем впервые выделен возбудитель рожи свиней?

4. Какой материал и как отправляют в лабораторию для диагностики рожи свиней?

5. Каковы морфологические особенности возбудителя рожи свиней при остром и хроническом течении?

6. Как проявляются культуральные свойства Erysipelothrix rhusiopathiae на питательных средах?

7. Что используют для видовой серологической диагностики рожи свиней и как ее проводят?

8. На каких видах лабораторных животных и как осуществляется биопроба при диагностике рожи свиней?

9. Какие имеются биопрепараты для профилактики, лечения и диагностики рожи свиней?

Тема 14. Лабораторная диагностика листериоза животных

14.1. Цель занятия

Ознакомиться со свойствами возбудителя листериоза и методами лабораторной диагностики болезни.

14.2. Материалы и оборудование

Культура вакцинного штамма возбудителя листериоза на МПА, в МПБ, стерильные МПА, МПБ в пробирках, пипетки Пастера, листериозная сыворотка, биопрепараты. Мультимедийное устройство и презентация по теме.

14.3. Теоретический материал

Листериоз — зооантропонозная болезнь животных и человека, характеризующаяся поражением центральной нервной системы, репродуктивных органов (аборты), молочной железы (маститы), признаками септицемии. Может протекать в форме бессимптомного носительства.

Возбудитель — Listeria monocytogenes и L. ivanovii. Род — Listeria. Листериоз животных учитывается с 1956 г. Регистрация и учет листериоза у людей как самостоятельной нозологической единицы введены Минздравом РФ в 1992 г. Листериоз животных подлежит обязательной регистрации, как особо опасная болезнь животных, с 2008 г.

Заболевание представляет опасность для 12 видов домашних и 91 вида диких животных. Восприимчивы к листериозу овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики, куры, гуси, утки, индейки. Листерии выделены от рыб, искусственно культивируемых моллюсков, ракообразных и земноводных. Болеют животные всех возрастов. Особенно чувствительны молодняк и беременные. Восприимчив человек.

Сезонность характерна только для овец. У других видов животных болезнь наблюдается в любое время года. Листериоз проявляется спорадически, редко в виде эпизоотии. Характерен длительный период микробоносительства. Стационарность листериоза обеспечивается наличием почвенных очагов и биологических резервуаров.

Инкубационный период — 7–30 суток. Течение острое, подострое и хроническое. Проявляется в нервной, септической, смешанной, бессимптомной формах, а также с преимущественным поражением репродуктивных органов и вымени.

У крупного и мелкого рогатого скота чаще поражается нервная система (некоординируемые движения, судороги, приступы буйства, парезы нижней челюсти и отдельных групп мышц, потеря зрения, конъюнктивит). При поражении репродуктивных органов — аборты, задержание последа, метриты. Иногда возникает мастит.

У телят и ягнят листериоз чаще протекает в виде септицемии. У взрослых свиней отмечают исхудание, анемию, кашель, нарушение координации движений, абсцессы в различных органах и тканях, аборты и рождение мёртвых поросят. У поросят чаще наблюдают поражение нервной системы. У птиц характерны потеря аппетита, угнетение, малоподвижность, конъюнктивит, слабость, судороги, параличи.

Факторы, способствующие возникновению листериоза у животных: неполноценное и однотипное кормление, уплотненное содержание животных на ограниченной территории, беременность, незаразные и паразитарные болезни, наличие в стаде листерионосителей. Схема распространения листериоза представлена на рисунке 14.1.

Рис. 14.1. Схема распространения листериоза

14.4. Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика (проводится согласно методической рекомендации Минздравмедпрома РФ, Минсельхозпрода РФ от 10.04.1996 г.): микроскопия мазков из исходного материала, посевы на питательные среды, отбор подозрительных колоний и идентификация выделенных культур, биохимическая активность, серологические свойства, постановка биопробы, серологическая идентификация в РСК, РА, РНГА, ИФА. Срок исследования — 10–14 дней.

14.5. Материал для исследования

В лабораторию посылают трупы мелких животных, от крупных животных — голову (головной мозг), селезенку, печень, почки, пораженные участки легких. Для прижизненной диагностики — абортированный плод с оболочками, истечения из половых органов, секрет пораженной доли вымени. В случае необходимости кровь или сыворотку крови от больных или подозреваемых в заболевании животных.

Бактериоскопия препаратов из исходного материала. Листерии — мелкие полиморфные палочки, располагающиеся одиночно, парами, напоминающие иногда римскую цифру пять, или по несколько штук параллельно, редко образуют короткие цепочки, c закругленными концами (рис. 14.2). Размеры: длина 0,8–4,0 мкм, ширина 0,3–0,5 мкм. В зависимости от условий культивирования листерии способны принимать кокковидную или овоидную форму. В культурах, выращенных при комнатной температуре, преобладают палочковидные формы, а в культурах, выращенных при температуре 37 °С, а также в старых культурах — кокковидные и овоидные формы. По Граму молодые культуры красятся положительно, старые — отрицательно или не определяются. Подвижны, имеют длинный полярный жгутик, который образуют при температуре 20–22 °С (но не при 37–38 °С). Спор не образуют. В крови вызывают моноцитоз. При обработке флюоресцирующей сывороткой светятся (рис. 14.2, г, д). При культивировании на сывороточных средах могут формировать капсулу.

Рис. 14.2. Листерии: а — в патологическом материале; б — колонии на МПА; в — колонии на оксфордском агаре; г — моноцитоз в крови; е — рост в МПБ

Выделение чистой культуры и идентификация возбудителя. Листерии — строгие аэробы или факультативные анаэробы. Растут на обычных питательных средах с довольно широким диапазоном рН (5,6–9,0). Наиболее благоприятными следует признать среды с рН 7,2–7,4, содержащие глицерин, глюкозу, сыворотку крови, а также печеночные среды. Лучшими питательными средами являются мясопептонный печеночный агар и бульон с добавлением 0,5% глюкозы и 2% глицерина. На МПА (лучше агар с добавлением 1% глюкозы и 2–3% глицерина) образуют мелкие росинчатые выпуклые колонии (при падающем свете — просвечивающиеся, беловатые с перламутровым оттенком, рис. 12, б). На кровяном агаре образуют зону бета-гемолиза. А на оксфордском агаре вокруг колоний появляется черный ореол (рис. 12, в). В МПБ листерии вначале вызывают равномерное помутнение среды с легкой опалесценцией, при встряхивании пробирки заметны муаровые волны, более грубые, чем при росте рожистых бактерий. На 5–7-й день бульон просветляется, и на дне образуется слизистый осадок, который при встряхивании поднимается в виде «косички» (рис. 12, г). Пленка и пристеночное кольцо не образуются. При посеве уколом на МПЖ листерии дают медленный рост в виде узловатой нити или полоски с небольшими отростками. Разжижение желатины не наступает. Свежевыделенные культуры листерии продуцируют растворимый, фильтрующийся β-гемолизин, способный разрушать эритроциты человека, лошади, крупного рогатого скота, овец, кроликов.

Биохимические свойства. Листерии разлагают с образованием кислоты без газа: глюкозу, рамнозу, салицин, левулезу, но не изменяют среду с дульцитом, маннитом, арабинозой, изулином, сорбитом. Они не образуют индола, аммиака, не восстанавливают нитраты в нитриты, не свёртывают и не пептонизируют молоко, не гидролизуют мочевину.

Постоянным признаком листерий, который может быть использован для дифференциации их от эризипелотриксов, является каталазная активность. К суточной бульонной культуре добавляют равный объем свежеприготовленной 5%-ной перекиси водорода. При исследовании агаровой культуры в пробирку вносят несколько капель перекиси водорода. Ели есть фермент каталаза, перекись водорода разлагается с образованием пузырьков газа (пена).

Для дифференциации листерии от возбудителя рожи свиней также можно использовать индикаторные среды; метод основан на редукции и оксидации красок в средах при выращивании листерии. Исследуемую бульонную культуру или смыв агаровой культуры засевают в объеме 2–4 капель не менее чем на две из пяти следующих индикаторных сред: с лакмусом, нейтральротом в смеси с метиленовой синью, метилротом, конгоротом, амидо черным. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37–38 °С вместе с контрольными (незасеянными) средами. Результат учитывают через 3–6 ч, 24, 48 ч. Возбудитель листериоза через 3–6 ч обесцвечивает среду с лакмусом и среду с нейтральротом в смеси с метиленовой синью до цвета бульона, лишь у поверхности на границе с воздухом остается окрашенный ободок. При встряхивании цвет частично восстанавливается, поэтому посевы просматривают, не встряхивая пробирки. Среда с метилротом обесцвечивается через 3–6 ч, но восстановление цвета среды не происходит. Обесцвечивание сред с конгоротом и с амидо черным происходит в более поздние сроки — через 6–48 ч, при этом исходный цвет среды после обесцвечивания не восстанавливается. Возбудитель рожи свиней не обесцвечивает ни одну из вышеуказанных сред.

Биопроба. Для биопробы используют белых мышей, морских свинок, кроликов. Результаты биопробы на белых мышах и кроликах представлены на рисунке 14.3, а и 14.3, б.

Рис. 14.3, а. Зараженные листериозом белые мыши. В центре здоровый мышонок. Справа и слева от него мыши-сосунки с параличом передних лапок

Рис. 14.3, б. Зараженные листериозом кролики. Слева — паралич после внутривенного заражения; справа — воспалительная реакция, резвившаяся на месте внутрикожного введения листерий

Иммунитет. Листерии вызывают снижение работы клеточного звена иммунитета, что приводит к распространению инфекции по всему организму. В органах и тканях образуются специфические гранулемы — листериомы. Их специфический состав определяется при микроскопировании мазка (рис. 14.4).

Рис. 14.4. Справа — гранулема (листериома) в головном мозге, слева — в печени

Определение чувствительности листерии к бактериофагам

Набор бактериофагов (включает два фага: L2A и L4A) позволяет идентифицировать более 85% культур листерий, однако могут быть выделены штаммы листерий, которые не лизируются данными фагами.

Содержимое ампул растворяют в МПБ или в бульоне Мартена в объеме, указанном на этикетке ампулы, и с соблюдением правил асептики переносят в пробирки. При наличии осадка, хлопьев или помутнения растворенные бактериофаги не пригодны к применению.

Неиспользованные растворенные бактериофаги могут быть применены в работе в течение 5–10 сут при хранении в холодильнике (2–6 °С), после предварительной проверки на отсутствие бактериального загрязнения.

Ампулы, пробирки и пипетки из-под бактериофага, а также выбракованный бактериофаг обезвреживают кипячением (не менее 30 мин).

Исследование проводят в бактериологических чашках, содержащих МПА с глюкозой (0,5%) или 2%-ный агар Мартена. Чашки с питательными средами необходимо подсушить (открывают и переворачивают вверх дном). Агар, разлитый накануне, подсушивают 20–30 мин при комнатной температуре, а разлитый в день исследования — 1–1,5 ч при 37 °С.

Для идентификации используют 16–18-часовую агаровую культуру, выращенную при 37 °С. Ее засевают в МПБ с глюкозой (0,5%) или в бульон Мартена. Количество посевного материала должно быть таким, чтобы после встряхивания в пробирке с бульоном образовалась легкая опалесценция. Культуры выдерживают в термостате (37 °С) 4 ч. После этого бактериальную взвесь сеют газоном на поверхность подсушенного 2%-ного агара в бактериологических чашках. Каждую культуру подвергают не менее чем 2–3 параллельным исследованиям.

В одной чашке можно одновременно проводить испытания двух культур. Для этого поверхность агара делят пополам и на каждую из половин наносят исследуемые культуры, которые распределяют равномерно отдельным шпателем по отмеченному участку агаровой пластинки. Чашки с засеянными культурами выдерживают в термостате (37 °С) 1–1,5 ч при слегка приоткрытой крышке.

Для исследования действия бактериофага на культуру листерий на газон испытуемой культуры тонко оттянутой пастеровской пипеткой или бактериологической петлей наносят по одной капле бактериофагов и отдельно каплю стерильного бульона (контроль). Место нанесения каждой капли отмечают карандашом по стеклу с наружной стороны чашки. Расстояние между наносимыми каплями должно быть не менее 1 см. Чашки после нанесения фага и бульона оставляют при комнатной температуре (22–23 °С) в затемненном месте.

Учет результатов проводят через 16–24 ч. Культуру признают листериями, если в месте нанесения одного из бактериофагов образуется прозрачная зона лизиса или полусливной лизис (в виде губки). Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста вторичной культуры в зоне лизиса при интенсивном бактериальном росте на остальной поверхности агара. В месте нанесения капли стерильного бульона зона лизиса отсутствует.

Быстрым специфическим методом обнаружения листерий, обеспечивающим выявление возбудителя в исследуемом материале без выделения его культуры, является реакция нарастания титра фага (РНФ) (см. «Инструкция о мероприятиях по профилактике и борьбе с листериозом животных»).

Серологическая диагностика. Пробы берут от животных любого возраста, подозреваемых в заболевании листериозом, а также от животных из поголовья, где заболевание подтверждено. От каждого животного берут из яремной вены 5–10 см³ крови в стерильные пробирки или используют кровь, полученную при убое животного. Получают сыворотку (пробирки с кровью выдерживают при температуре 20–30 °С 30–60 мин, а затем при температуре 4–10 °С). Она должна быть прозрачной, без признаков гемолиза. Допускается консервировать сыворотку 5%-ным раствором карболовой кислоты (1–2 капли на 1 см³ сыворотки) или сухой борной кислоты (2% кислоты к объему сыворотки). Не консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия пробы, сыворотки консервированные — в течение 30 сут.

Реакция агглютинации. Реакцию агглютинации (PA) в диагностике листериоза применяют с целью обнаружения листериозных агглютинирующих макроглобулиновых (19S) и микроглобулиновых (7S) антител.

Компоненты реакции и условия их применения. Для исследования используют консервированные и неконсервированные сыворотки крови без признаков гнилостного распада и гемолиза.

В реакции применяют антигены первой и второй серогрупп, представляющие собой взвесь инактивированных листерий, выпускаемых в лиофилизированном виде. Перед применением необходимо добавить к ним физиологический раствор с рН 7,2 в количестве, указанном на этикетке. Разведенные антигены можно хранить при 4 °С в течение 1,5–2 месяцев. Перед употреблением антигены тщательно встряхивают.

Для контроля используют первую и вторую серогрупповые агглютинирующие листериозные сыворотки, содержащие 19S- и 7S-антитела, а также нормальную (отрицательную) сыворотку.

Для дифференцирования 19S- и 7S-антител используют 2-меркаптоэтанол (2-МЭ) или солянокислый цистеин, который избирательно разрушает макроглобулины (19S).

Постановка реакции агглютинации:

1. Испытуемые сыворотки исследуют параллельно с двумя антигенами. При исследовании сывороток крупного рогатого скота и лошадей реакцию ставят в разведениях 1:160 и 1:320, овец, коз и свиней — 1:80 и 1:160, кроликов 1:20 и 1:40. Разведение сывороток делают в физиологическом растворе.

2. Реакцию проводят в объеме 1 мл. При исследовании сывороток кроликов в первую пробирку наливают 0,9 мл физиологического раствора, во вторую — 0,5 мл. Затем в первую пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки, перемешивают и переносят 0,5 мл во вторую пробирку. Из второй пробирки 0,5 мл смеси удаляют. Получают разведение сывороток 1:10 и 1:20. Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают разведение сывороток 1:20 и 1:40.

3. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота и лошадей сначала готовят основное разведение сыворотки — 1:40, для чего в пробирки наливают 0,1 мл сыворотки и 3,9 мл физиологического раствора. Затем из полученного разведения готовят рабочие разведения сыворотки: наливают в две пробирки по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку переносят 0,5 мл основного разведения сыворотки, перемешивают и 0,5 мл смеси переносят во вторую пробирку. Затем из нее удаляют 0,5 мл смеси, после чего в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают разведение сывороток 1:160 и 1:320.

4. При исследовании сывороток крови овец, коз и свиней готовят основное разведение сыворотки 1:20 (0,1 мл сыворотки плюс 1,9 мл физиологического раствора). Для приготовления рабочих разведений наливают в две пробирки по 0,5 мл физиологического раствора. В первую пробирку переносят 0,5 мл основного разведения сыворотки, перемешивают и 0,5 мл смеси из нее переносят во вторую пробирку. Из второй пробирки удаляют 0,5 мл смеси. Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл разведенного антигена. Получают необходимое разведение сыворотки 1:80 и 1:160.

5. При постановке реакции с испытуемыми сыворотками одновременно ставят контрольные:

• с отрицательной сывороткой в тех же разведениях, что и испытуемые;

• с положительной агглютинирующей сывороткой соответствующего серовара, содержащей 7S-антитела, в разведении до ее предельного общего титра;

• 1 мл разведенного антигена первой серогруппы (одну пробирку) и 1 мл разведенного антигена второй серогруппы (одну пробирку) — для контроля антигена.

6. Пробирки с испытуемыми и контрольными сыворотками и антигенами выдерживают в термостате 18–20 ч при 37 °С, затем при комнатной температуре — в течение 1,5–2 ч, после чего учитывают результаты реакции.

Учет и диагностическая оценка реакции

Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ — полное просветление жидкости при наличии четко выраженного зонтика, который при встряхивании разбивается на мелкие хлопья, комочки;

+++ — те же явления, но надосадочная жидкость слегка опалесцирует;

++ — просветление жидкости выражено слабее, имеется недостаточно четко сформированный зонтик, при встряхивании разбивается на мелкие хлопья и крупинки;

+ — незначительное просветление при наличии зонтика, при встряхивании — мелкие крупинки и комочки;

— отрицательная, отсутствие, просветления и зонтика.

Реакция признается положительной при обнаружении агглютинации с оценкой не менее чем на два креста в разведениях сыворотки 1:160 для овец, свиней и коз; 1:320 для крупного рогатого скота, лошадей; 1:40 для кроликов. Сыворотки, давшие отрицательную реакцию в указанных разведениях, подлежат дополнительной обработке 2-МЭ или солянокислым цистеином.

Обработка сывороток 2-МЭ:

• 2-МЭ — бесцветная жидкость, обладающая запахом, поэтому работу с 2-МЭ проводят в вытяжном шкафу. Рабочий раствор 2-МЭ готовят непосредственно перед применением, разводя исходный препарат дистиллированной водой согласно титру, указанному на этикетке флакона;

• сыворотки крови кроликов разводят физиологическим раствором 1:5 (0,2 мл сыворотки плюс 0 > 8 мл физиологического раствора), сыворотки овец, коз и свиней — 1:10 (0,1 мл сыворотки плюс 4–0,9 мл физиологического раствора), сыворотки крови крупного рогатого скота и лошадей — 1:20 (0,05 мл сыворотки плюс 0,95 мл физиологического раствора);

• затем к 1 мл разведенной сыворотки добавляют 1–2 капли рабочего разведения 2-МЭ. Пробирки плотно закрывают резиновыми пробками и помещают в водяную баню (37 °С) на 1 ч. После этого сыворотку, обработанную 2-МЭ, разливают в 2 пробирки по 0,5 мл и в одну из них добавляют 0,5 мл разведенного антигена первой серогруппы, в другую — 0,5 мл разведенного антигена второй серогруппы. Получают разведение 1:10 для сывороток кроликов, 1:20 — овец, коз и свиней, 1:40 — для сывороток крови крупного рогатого скота и лошадей.

При постановке реакции с испытуемыми сыворотками одновременно ставят следующие контроли:

• отрицательной сывороткой в том же разведении, что и испытуемые;

• с агглютинирующей сывороткой, содержащей 19S-антитела, в том же разведении, что и испытуемые;

• с агглютинирующей сывороткой, содержащей 7S-антитела, в разведении до предельного титра 7S-антител;

• 1 мл разведенного антигена первой серогруппы (одна пробирка) и 1 мл разведенного антигена второй серогруппы (одна пробирка) — для контроля антигена.

Агглютинирующие контрольные сыворотки обрабатывают 2-МЭ так же, как и испытуемые. Отрицательная сыворотка обработке 2-МЭ не подлежит.

Пробирки с контрольными и испытуемыми сыворотками и антигенами выдерживают в термостате 18–20 ч при 37 °С, затем при комнатной температуре — 1,5–2 ч, после чего учитывают результаты реакции.

Обработка сывороток солянокислым цистеином. Раствор цистеина готовят непосредственно перед применением. Для получения рабочего раствора цистеина 35,1 мг препарата растворяют в 1 мл 0,2 М NaOH. Для приготовления 0,2 М раствора едкого натра растворяют 8 г реактива в 1 л дистиллированной воды.

Сыворотки крови кроликов разводят в 2,5 раза (0,2 мл сыворотки плюс 0,3 мл физраствора), овец, коз и свиней — 1:5 (0,1 мл сыворотки плюс 0,4 мл физраствора), крупного рогатого скота и лошадей — 1:10 (0,05 мл сыворотки плюс 0,45 мл физраствора). Затем к 0,5 мл разведенной сыворотки добавляют 0,5 мл рабочего раствора цистеина. Пробирки закрывают резиновыми пробками и выдерживают в течение 18–20 ч в термостате при 37 °С. После этого сыворотку, обработанную цистенном, разливают в две пробирки по 0,5 мл, в одну из них добавляют 0,5 мл разведенного антигена первой серогруппы, в другую — 0,5 мл разведенного антигена второй серогруппы. Получают разведение сыворотки 1:10 для кроликов, 1:20 — для овец, коз и свиней и 1:40 для крупного рогатого скота и лошадей. Контроли реакции ставят как при обработке сывороток 2-МЭ с последующим выдерживанием испытуемых и контрольных проб при 37 °С (18–20 ч) и при комнатной температуре (1,5–2 ч).

Учет и оценка реакции после обработки сывороток 2-МЭ или солянокислым цистеином:

1. Реакция признается положительной при обнаружении агглютинации с оценкой не менее чем на два креста в сыворотках, обработанных 2-МЭ или цистеином, в разведении 1:10 для кроликов, 1:20 — для овец, коз и свиней, 1:40 — для крупного рогатого скота и лошадей. При этом контрольная агглютинирующая сыворотка, содержащая 19S-антитела, должна дать отрицательную реакцию в том же разведении, а контрольная сыворотка, содержащая 7S-антитела, положительную реакцию в разведении до предельного титра 7S-антител.

2. При оценке реакции необходимо учитывать, что цистеин легко окисляется на воздухе, образуя мелкие крупинки, которые можно легко отличить от специфической агглютинации.

3. В заключении лаборатории о результатах исследования проб сывороток крови должна быть сообщена диагностическая оценка результатов исследования (положительная или отрицательная).

Реакция связывания комплемента при листериозе

РСК с листериозным антигеном