Р. Т. Маннапова

Микробиология, микология и основы иммунологии

Учебник

ebooks@prospekt.org

Информация о книге

УДК [579+577.27](076.5)

ББК 28.4я73+28.074я73

М23

В оформлении обложки использованы изображения из архива автора

Автор:

Маннапова Р. Т., доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и иммунологии Российского государственного аграрного университета – Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Рецензенты:

Андреева А. В., доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы Башкирского государственного аграрного университета;

Дюльгер Г. П., доктор ветеринарных наук, доцент, заведующий кафедрой ветеринарной медицины Российского государственного аграрного университета – Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Учебник состоит из восьми разделов. В нем изложены методы морфологических, физиологических исследований микроорганизмов, серологических, иммунологических и молекулярных методов диагностики. Книга содержит подробный материал о возбудителях особо опасных инфекционных болезней, микозов и кормовых микотоксикозов. Разделы составлены и изложены по единому плану. По каждой теме представлена теория вопроса, описаны материалы и оборудование, методика выполнения. Даны задания для самостоятельной работы и вопросы для контроля знаний. Ко всем инфекционным болезням, микозам и микотоксикозам в разделе 8 приведены схемы лабораторной диагностики и специфической профилактики. Представлен раздел микробиологии продуктов животного происхождения и кормов, в котором описаны вопросы их микробиологической контаминации и анализа. В разделе санитарной микробиологии предложены методы бактериологического исследования воды, почвы и воздуха. В учебнике дана подробная характеристика вопросам превращения микроорганизмами соединений углерода и азота. В конце книги приведен терминологический словарь, сведения об основоположниках микробиологии и иммунологии и лауреатах Нобелевской премии.

Предназначен для подготовки специалистов с учетом требований программы ФГОС ВО по направлению 36.05.01 «Ветеринария», а также магистров и бакалавров по направлению 36.04.01/36.03.01 «Ветеринарно-санитарная экспертиза».

УДК [579+577.27](076.5)

ББК 28.4я73+28.074я73

© Маннапова Р. Т., 2023

© ООО «Проспект», 2023

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ | — | антиген
АМФ | — | альвеолярные макрофаги
АПК | — | антигенпрезентирующая клетка
АТ | — | антитело
БГКП | — | бактерии группы кишечной палочки
БЦЖ | — | вакцина Кальметта–Герена
ВГНКИ | — | Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов
ГАС | — | генерализованный адаптационный синдром
ГЗТ | — | гиперчувствительность замедленного типа
Г-КСФ | — | гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГМ-КСФ | — | гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
ДПН | — | дифосфопиридиннуклеотид
Е-РОК | — | метод «спонтанных розеток»
ЕАС-РОК | — | метод розеткообразования
ЖСА | — | желточно-солевой агар
ИД | — | инфекционная доза
ИФА | — | иммуноферментный анализ
ИЛ | — | интерлейкин
ИЭФ | — | иммуноэлектрофорез
КАМ | — | комплементный антиген из атипичных микобактерий
ККРНГА | — | кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации
КСФ | — | колониестимулирующий фактор
КР | — | кольцевая реакция агглютинации с молоком
КУА | — | казеиново-угольный агар
ЛД | — | летальная доза
ЛТФ-130 | — | лиофилизированная вакцина против трихофитии крупного рогатого скота
МАФАМ | — | мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микробы
МАС | — | местный адаптационный синдром
МБцК | — | минимальная бактерицидная концентрация
МПА | — | мясо-пептонный агар
МПБ | — | мясо-пептонный бульон
МПЖ | — | мясо-пептонный желатин
МПК | — | минимальная подавляющая концентрация
мРНК | — | матричная рибонуклеиновая кислота
МФА | — | метод флюоресцирующих антител
2-МЭ | — | 2 мер-каптоэтаиолом (для обработки сывороток)
НСТ-тест | — | тест с нитросиним титразолием
ОМЧ | — | общее микробное число
ПЖА | — | полужидкий мясо-пептонный агар
ПМФ | — | перитониальные макрофаги
ПЦР | — | полимеразная цепная реакция
РА | — | реакция агглютинации
РБП | — | проба с бенгальским розовым
РБТЛ | — | реакция бласттрансформации лимфоцитов
РДП | — | реакция диффузной преципитации
РИФ | — | реакция иммунной флюоресценции
РК | — | реакция Кумбса
РКП | — | реакция кольцепреципитации
РМА | — | реакция микроагглютинации
РН | — | реакция нейтрализации
РНГА | — | реакция непрямой гемагглютинации
РНК | — | рибонуклеиновая кислота
РП | — | реакция преципитации
рРНК | — | рибосомальная рибонуклеиновая кислота
РСК | — | реакция связывания комплемента
РТГА | — | реакция торможения гемагглютинации
РТПХ | — | реакция «трансплантат против хозяина»
СЖН | — | сафранино-железоновобиоцеоновая среда
СПМ | — | санитарно-показательные микроорганизмы
тРНК | — | транспортная рибонуклеиновая кислота
ФНО | — | фактор некроза опухоли
ФСБР | — | фосфатно-солевой буферный раствор
ФЭВ | — | ферментативное экстрагенное вещество
ЦИК | — | циркулирующий иммунный комплекс
ЧБК | — | чистая бактериальная культура
BCR | — | рецептор В-лимфоцита
Ig | — | иммуноглобулин
MHC | — | (Major Histocompatibility Complex, произносится «эм эйч си») — главный комплекс гистосовместимости
NK | — | (от англ. natural killer) — естественный киллер
pH | — | концентрация водородных ионов
TCR | — | рецептор Т-лимфоцитов
АМФ | — | альвеолярные макрофаги
АПК | — | антигенпрезентирующая клетка
БГКП | — | бактерии группы кишечной палочки

Посвящается светлой памяти
моих родителей — Тимергалея
Фахразетдиновича и Нурзиды
Динисламовны Рафиковых

ПРЕДИСЛОВИЕ

Учебник «Микробиология, микология и основы иммунологии» подготовлен для обучения специалистов с учетом требований программы ФГОС ВО по направлениям 36.05.01 «Ветеринария» и 36.04.01/36.03.01 «Ветеринарно-санитарная экспертиза». Он может быть использован при чтении лекций, проведении лабораторно-практических, факультативных занятий и выполнении научных исследований. В нем значительное внимание отводится самостоятельной подготовке студентов по курсам «Ветеринарная микробиология и микология», «Микробиология и основы иммунологии». С этой целью к учебнику подготовлено и выпущено учебное пособие «Микробиология, микология и основы иммунологии. Самоконтроль знаний, тестирование студентов», что дает возможность студенту самостоятельно пройти тренажер по теоретическому курсу и тестированный контроль по лабораторно-практическому занятию к каждой пройденной теме при подготовке к очередному занятию, коллоквиуму, зачету, итоговому контролю знаний и при подготовке к интернет-экзамену.

Учебник подготовлен в удобной форме как для студентов, так и для преподавателей дисциплин. Составлен с учетом региональных особенностей, современного состояния животноводства в целом по Российской Федерации, а также современных международных требований для подготовки востребованных конкурентоспособных специалистов для сельского хозяйства — ветеринарных врачей и ветеринарно-санитарных экспертов, в условиях рыночной экономики.

Учебник состоит из семи разделов. Первый раздел посвящен общей микробиологии и последовательно отражает все основные вопросы морфологии и физиологии микроорганизмов. Раздел представлен в виде девяти тем ЛПЗ.

Во втором разделе учебника представлены основные вопросы иммунологии, серологические реакции, методы выделения и исследования иммунокомпетентных клеток, их фракционирования и идентификации. Особое внимание уделяется изучению неспецифических клеточных и гуморальных факторов естественной резистентности организма, с количественным определением иммуноглобулинов различных классов, оценки функциональной активности лейкоцитов и медиаторов межклеточного взаимодействия — цитокинов. В доступной форме в учебнике представлены молекулярные методы диагностики — полимеразной цепной реакции (ПЦР — анализа материала) и метод иммуноферментного анализа (ИФА). Параллельно с лекционным материалом информация второго раздела учебника позволит студентам хорошо освоить иммунологию и современные вопросы иммунодиагностики, иммунотерапии и иммунопрофилактики особо опасных зооантропонозных инфекционных болезней, микозов и микотоксикозов.

Самым важным и главным разделом учебника является третий, в котором представлены в восьми главах различные группы всех возбудителей особо опасных инфекционных болезней. Четвертый раздел посвящен микозам и микотоксикозам. Они по общим признакам объединены в четыре главы. Оба раздела написаны по единой общей схеме: определение болезни, возбудитель в латинской транскрипции, его морфология, культуральные, биохимические, токсигенные и антигенные свойства, патогенность и патогенез, устойчивость, диагностика, дифференциальная диагностика, патологическая анатомия, лечение, иммунитет, специфическая профилактика. По всем инфекциям, микозам и микотоксикозам в восьмом разделе учебника представлены схемы лабораторной диагностики и специфической профилактики.

Учебник поможет студентам в облегчении восприятия возбудителей особо опасных инфекционных болезней, микозов и микотоксикозов, лучшего освоения материалов, выносимых на лекции, лабораторно-практические занятия и на самостоятельное изучение.

В пятом разделе учебника представлены возможности контаминации бактериями и методы микробиологического исследования продуктов животного происхождения: молока, масла, сыров, мяса, яиц, а также кормов.

Шестой раздел учебника посвящен изучению объектов внешней среды — санитарной микробиологии воды, почвы и воздуха, их обсеменения микробами и методы бактериологического анализа с определением их общей бактериальной загрязненности, coli-титра, сoli-индекса.

В седьмом разделе учебника описаны вопросы превращения микроорганизмами соединений углерода (молочнокислое, спиртовое и маслянокислое брожение) и азота (азотфиксация, аммонификация, нитрификация, денитрификация).

Учебник составлен в классическом стиле, для наглядности снабжен иллюстрациями (в виде цветных и черно-белых фотографий, электроннограмм) и таблицами, отражающими краткие сводки по ключевым аспектам. Надеемся, что он удовлетворит запросы студентов, аспирантов, преподавателей, научных сотрудников, всех, кому он адресован.

Автор выражает искреннюю благодарность рецензентам за ценные замечания и пожелания по улучшению учебника и всем, кто оказал содействие в его подготовке. Замечания и пожелания присылайте на кафедру микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева Маннаповой Р. Т.

Раздел 1. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ: МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Глава 1.1. Знакомство с микробиологической лабораторией и техникой безопасности при работе с микробиологическими объектами. Оптическая и иммерсионная системы микроскопа. Морфология микроорганизмов

1.1.1. Цель занятия

Усвоить правила работы в бактериологической лаборатории. Ознакомиться с техникой безопасности и личной профилактикой. Освоить работу с микроскопом и особенностями иммерсионной системы. Изучить основные формы бактерий.

1.1.2. Материалы и оборудование

Микроскопы, окрашенные микроскопические препараты с различными формами микроорганизмов, штативы, пробирки, микробиологические петли, пастеровские пипетки, красители, капельницы с растворами красителей, вставленные в гнезда штативов-колодок, песочные часы, чашки сливные, мостики, микроскопы, вода дистиллированная в колбах для смыва красителей с мазков, банки с дезинфицирующими растворами для отработанных предметных и покровных стекол, салфетки для снятия масла с иммерсионного (× 90) объектива, иммерсионное масло (кедровое или его заменители). Таблицы: схемы устройства биологических микроскопов в разрезе и прохождения лучей в них, схемы устройства и принципы действия электронных микроскопов (просвечивающих, растровых). Формы микроорганизмов.

1.1.3. Теоретический материал

Основная задача бактериологических лабораторий — диагностика болезней сельскохозяйственных животных (включая птиц), пушных зверей, рыб, пчел, а также проведение экспертизы молока, мяса и других пищевых продуктов и кормов.

Лабораторию размещают в отдельном здании, вдали от проезжих дорог. В ней предусматривают приемное отделение, бактериологический, вирусологический, биохимический, серологический и патологоанатомический отделы; выделяют специальные помещения для термостатов, стерилизации посуды и питательных сред, для мытья посуды. Для выполнения работы в асептических условиях оборудуют специальные изолированные помещения — боксы. Лабораторных животных размещают в виварии. Кроме того, имеются комнаты для специалистов, обслуживающего персонала, кабинет заведующего, помещения для библиотеки, склада, весовой, раздевалки и др.

В моечной должны быть столы, раковины, электрические или газовые плиты, сушильный, вытяжной и другие шкафы. Вытяжной шкаф необходим для удаления паров воды и некоторых реактивов, используемых при мойке стекол и посуды. Пол и стены желательно облицевать плиткой.

В стерилизационной комнате могут быть 1 или 2 паровых стерилизатора и стол. При наличии 2 паровых стерилизаторов занятия в нескольких подгруппах можно проводить без длительного перерыва.

Стерилизационная комната должна хорошо вентилироваться. Пар из стерилизатора до подъема давления выводят через резиновую трубку во внешнюю среду или направляют в ведро с водой. Дверь (без стекла) и окна должны открываться наружу.

Средоварочная комната служит для приготовления питательных сред. Стены ее должны быть облицованы плиткой, или покрашены масляной краской, пол выстлан плиткой или покрыт линолеумом. В средоварочной необходимы газовая или электрическая плита, электроплитки, ящики с отсеками для сред в пробирках, столы, шкафы для хранения компонентов сред, мясной воды и некоторых сред в колбах, холодильник.

В термостатной могут находиться термостаты разных форм и размеров. Для выращивания плесневых грибов температура в термостате обычно составляет 20–35 °C, для большинства сапрофитов — 25–30 °C, для возбудителей инфекционных болезней — 35–37 °C, термофилов — 40–45 °C и т. д.

Препараторская — место работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к лабораторно-практическим занятиям.

Бокс-комната используется для посевов и пересевов культур микроорганизмов и проведения научно-исследовательской работы в стерильных условиях. Бокс должен быть застеклен, и иметь предбоксник (тамбур) с раздвижной дверью. Стекла нужно хорошо промазать, чтобы не проникал воздух, а вместе с ним и микроорганизмы, стены облицевать плиткой, или окрасить белой масляной краской, пол покрыть линолеумом. Уборку в боксе производят влажным способом с применением дезинфицирующих средств (2–3% раствором натрия гидрокарбоната — питьевой соды, 3–5% раствором фенола и т. д.). Воздух стерилизуют бактерицидными лампами (БУВ-15, БУВ-30 и др.), которые излучают ультрафиолетовые лучи длиной 254 нм.

В зависимости от степени загрязненности воздуха стерилизацию осуществляют от 30 мин до нескольких часов. Находиться в комнате с включенной бактерицидной лампой нежелательно, так как ультрафиолетовые лучи вызывают острое воспаление роговицы глаз. Для предупреждения поражения необходимо пользоваться защитными очками.

В виварии содержат белых мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов и других лабораторных животных. Их чаще используют в научно-исследовательской работе, реже на занятиях, поэтому при отсутствии определенных условий виварий не создают.

Реактивы и некоторые биологические препараты хранят в подвальном помещении или темном сухом стенном шкафу с невысокой температурой в течение года.

Правила работы, техника безопасности и личная профилактика в ветеринарно-бактериологических лабораториях

1. В помещение входить только в халате и белой шапочке (косынке).

2. В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, продукты.

3. В помещении лаборатории категорически запрещается есть.

4. Перед началом работы обязательно проверяют наличие и исправность приборов, посуды, горелок и др. О замеченных недостатках, неисправностях сообщают преподавателю или лаборанту.

5. Нельзя зажигать одну горелку от другой.

6. Не касаться металлическими и другими предметами проводов и контактных частей электросети. Не включать без ведома преподавателя или лаборанта любую электроаппаратуру.

7. Материал, используемый для учебных занятий, должен рассматриваться как особо опасный.

8. При распаковке материала, присланного для исследования, необходимо соблюдать осторожность — банки с материалом снаружи обтирают ватой, смоченной дезинфицирующим раствором и ставят только на подносы.

9. При исследовании поступившего материала и работе с бактериологическими культурами придерживаются общепринятых в микробиологической практике правил исключающих возможность инфицирования работника.

10. Вскрытие трупов лабораторных животных производят в специальной одежде, на соответственно оборудованном столе с помощью необходимых инструментов, используя для этих целей кювету, залитую воском (или парафином). Инструменты после вскрытия помещают в стакан с дезраствором или обжигают на пламени горелки, на стол класть запрещается.

11. При работе с жидким инфицированным материалом используют резиновые баллоны, соединенные с пипеткой..Жидкости, содержащие микробов, переливают над сосудом с дезраствором.

12. Если патологический материал попал случайно на стол, его немедленно удаляют тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. При попадании зараженного материала на кожу, конъюнктиву, слизистую ротовой полости принимают экстренные меры к обеззараживанию.

13. По окончании работы патологический материал, использованные культуры микроорганизмов, инструменты и поверхность стола обеззараживают. В конце занятия бактериальные культуры и другой материал студенты сдают преподавателю, а рабочее место приводят в порядок.

14. Перед уходом из лаборатории необходимо снять халат, вымыть руки и обработать их спиртом.

Устройство светового микроскопа и работа с ним

Микроскоп — это оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов, невидимых невооруженным глазом. Студенческие лаборатории обычно оснащены биологическими микроскопами «Биолам Р-1», МБР-1 (Рис. 1.1.3.1), МБР-3 и др. В микроскопе различают механическую и оптическую части.

Механическая часть включает штатив, предметный столик, тубус и систему винтов для передвижения. Штатив обычно цельнометаллический или пластмассовый с подковообразной или прямоугольной ножкой (микроскопы серии «Биолам»), что обеспечивает устойчивость микроскопа. С его основанием соединена коробка с размещенным в ней механизмом микрометрической фокусировки. К верхней ее части прикреплен предметный столик; по форме он может быть круглый (в старых системах прямоугольный). На его поверхности для фиксации предметных стекол имеются клеммы-зажимы, вставленные в специальные отверстия. По сторонам предметного столика расположены центровочные винты, при помощи которых он перемещается в разных направлениях. К другой стороне коробки при помощи зубчатки (кремальеры) прикреплен дугообразный или прямоугольный тубусодержатель. В верхней его части расположено револьверное устройство, состоящее из двух пластин и соединенное с тубусом. Нижняя пластина вращается и имеет гнезда для ввинчивания объективов, верхняя закреплена неподвижно.

Тубус (труба) может быть наклонным и прямым. В его верхнюю часть вставляется окуляр. Передвижение тубусодержателя и смонтированных на нем систем осуществляется при помощи винтов. Для грубой наводки служит макрометрический винт, для более точной — микрометрический, полный оборот которого поднимает или отпускает тубусодержатель на 0,1 мм.

На барабане микрометрического винта нанесено 50 делений, каждое из которых соответствует перемещению системы на 2 мкм. Механизм макрометрической фокусировки состоит из системы зубчатых колес и рычага. Во избежание поломок обращаться с ним нужно осторожно. Не рекомендуется вращать его до упора. При вращении рукояток макро- и микрометрического винтов по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, против часовой стрелки — поднимается. Вращением рукояток грубой наводки навстречу друг другу находим изображаемый объект.

Оптическая часть включает объективы, окуляры и осветительный аппарат. Объективы — самая важная и наиболее ценная часть микроскопа. Они представляют систему линз, закрепленных в металлической оправе, число которых доходит до 10. Передняя (фронтальная) линза — самая малая, она производит основное увеличение, остальные (коррекционные) исправляют недостатки оптического изображения. Объективы делят на ахроматы и апохроматы. Первые имеют дефект — хроматическую аберрацию (происходит разложение света на составные части спектра). Они просты по устройству и дешевы, поэтому нашли наибольшее распространение. Апохроматы лишены такого недостатка. Они состоят из большого количества линз, изготовленных из стекла разного химического состава.

Все объективы делят на сухие и иммерсионные (погруженные в масло или воду). У сухих между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом находится воздух, у иммерсионных пространство между линзой и препаратом заполнено маслом (кедровым, касторовым, гвоздичным и др.) или водой. Стекло, на котором изготовлен препарат, стекло объективов и масло (кедровое) имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,25 и 1,515). Лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, свет не рассеивается, изучаемые объекты хорошо видны и не искажаются. Показатель преломления света, близкий к стеклу, имеет и другие вещества: касторовое масло (1,48–1,49), гвоздичное масло (1,53), смесь касторового и гвоздичного масел (1,515). Воздух и стекло имеют различные данные преломления света (1,0 и 1,52), в результате чего, лучи света при переходе из одной среды в другую преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение объектов. Однако поскольку сухие системы дают сравнительно небольшое увеличение, сильных искажений не наблюдается.

Рис. 1.1.3.1. Микроскоп МБР-1: 1 — подошва или башмак; 2 — предметный столик; 3 — винты для перемещения предметного столика; 4 — клеммы; 5 — конденсор; 6 — кронштейн конденсора; 7 — винт, укрепляющий конденсор; 8 — винт конденсора; 9 — рукоятка ирисовой диафрагмы конденсора; 10 — зеркало; 11 — тубусодержатель; 12 — макрометрический винт; 13 — микрометрический винт; 14 — револьвер; 15 — объектив; 16 — тубус; 17 — винт для крепления тубуса; 18 — окуляр

Для иммерсионных объективов характерно короткое фокусное расстояние и большое увеличение. Расстояние между фронтальной линзой и препаратом невелико, поэтому пользоваться этой системой во избежание повреждения линзы и препарата нужно осторожно. Иммерсионные объективы (х 90) рабочих (студенческих) микроскопов имеют пружинную оправу, что исключает повреждение фронтальной линзы и препарата при их соприкосновении. Сухие системы имеют следующие обозначения: ×8, ×20, ×40.

Окуляры вставлены в верхнюю часть тубуса. Они состоят из двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклыми сторонами к объективу и заключены в металлическую оправу. Между линзами имеется постоянная металлическая диафрагма. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, к объективу — собирательной. Короткие окуляры дают более сильное увеличение, длинные — слабое. Окуляры в зависимости от этого обозначаются: ×7, ×10, ×15, ×20. Цифры на объективах и окулярах показывают увеличение этих систем. Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Так, при увеличении объектива ×8 и окуляра ×7 увеличение микроскопа равно 56, объектива ×90 и окуляра ×20–1800.

Разрешающая способность микроскопа — это величина, обратная тому наименьшему расстоянию, на котором могут быть видны раздельно два соседних элемента структуры. Это одна из важных характеристик микроскопов, в том числе электронных. Самая высокая разрешающая способность у просвечивающих микроскопов. Они превосходят по этому параметру световые микроскопы в несколько тысяч раз. Высокое разрешение у электронных микроскопов достигается очень малой длиной волны электронов. Чем короче длина волны источника излучения, тем выше разрешающая способность микроскопа. Она составляет 1350 (90×15).

Осветительный аппарат находится под предметным столиком и представлен конденсором Аббе, диафрагмой и зеркалом. Конденсор Аббе состоит из двух линз, заключенных в металлическую оправу и предназначенных для собирания лучей света, идущих от зеркала. Ирисовая диафрагма находится под конденсором и служит для регулирования освещения препарата путем сужения или расширения ее при помощи рычага. Окрашенные препараты, частично задерживающие свет, рассматривают при открытой диафрагме. Неокрашенные препараты (висячую или придавленную капли) рассматривают с полуоткрытой диафрагмой в слабом пучке света. В таком поле зрения увеличивается контрастность неокрашенных форм микробов, что облегчает их нахождение. Микроскопы серии «Биолам» имеют дополнительную откидную линзу в оправе, которая используется при работе с объективами малого увеличения, зеркало — плоскую и вогнутую поверхности и служит для отражения лучей света. Плоским зеркалом пользуются при хорошем естественном освещении и при микрофотосъемках, вогнутым — при искусственном и слабом естественном.

Микроскоп МБИ-1 имеет два тубуса: наклонный и вертикальный. Первый позволяет рассматривать объекты на горизонтальной поверхности предметного столика. Макро- и микрометрический винты расположены в нижней части штатива. При их вращении руки лежат на столе и длительная работа не вызывает усталости. Бинокулярные микроскопы МБР-3, «Биолам» и другие имеют два наклонных тубуса, что позволяет рассматривать препарат обоими глазами.

Микроскопы, используемые при работе студентов, дают плоское увеличение. В настоящее время применяются объемные микроскопы, которые позволяют рассматривать исследуемый объект в трех измерениях. Такой эффект достигается путем смены фокусного расстояния 50 раз в минуту, создавая оптическое впечатление объемности.

В проекционных микроскопах большое значение имеет освещенность препаратов. Чем она выше, тем лучше видимость. К ним относится лазерный микроскоп с мощным усилителем света, который в отличие от других подобных источников не разрушает биологические объекты и позволяет проецировать изображение на экран.

Работа с иммерсионной системой

Объективы малого увеличения (×3,5, ×8, ×9) применяют главным образом для предварительного осмотра препарата, объективы среднего увеличения (×20, ×40) — для изучения крупных клеток микроорганизмов (например, грибов); эти объективы называются сухими, поскольку при микроскопии между фронтальной линзой и препаратом находиться воздух. При этом благодаря различию показателей преломления воздуха (n = 1) и стекла (n = 1,52) часть лучей, освещающих препарат, рассеивается и не попадает в объектив.

Объективы больших увеличений (×85, ×90) носят название иммерсионных. При работе с ними необходима максимальная освещенность препарата; устранение рассеивания, неизбежного при работе с сухими объективами, в данном случае достигается путем использования иммерсионных жидкостей, у которых показатель преломления близок к показателю преломления стекла (рис. 1.1.3.2).

Рис. 1.1.3.2. Схема лучей в иммерсионной системе: 1 — объектив микроскопа; 2 — предметное стекло; 3 — объект исследования; 4 — иммерсионное масло; 5 — лучи света; 6 — фронтальная линза объектива

Вначале под малым увеличением микроскопа наводят свет и определяют на препарате участок микроскопирования. Затем на выбранное место наносят каплю кедрового масла и осторожно (под контролем глаз с боку) погружают в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива (×90).

По окончании работы объектив поднимают, убирают препарат, а с фронтальной линзы кусочком фильтровальной бумаги убирают остатки масла. Иммерсионные объективы имеют короткое фокусное расстояние (до 2,3 мм) поэтому наводить на резкость следует путем поднимания объектива, а не опускания его, так как при небольшом рабочем расстоянии можно раздавить препарат и повредить фронтальную линзу. После грубой наводки, которую проводят с помощью макрометрического винта, руки переводят на микрометрический винт и осуществляют более точную фокусировку

Морфология микроорганизмов

По форме бактерий подразделяют на три основные группы: шаровидные (кокки), цилиндрические (палочки) и извитые (рис. 1.1.3.3.).

Рис. 1.1.3.3. Основные формы бактерий: а — микрококки; б, в — диплококки; г — стрептококки; д — стафилококки; е — тетракокки; ж — сарцины; з, и, к — палочки; л — вибрионы; м — спириллы

Кокки. Шарообразные факультативно-анаэробные, редко подвижные, не образующие спор микробы. Кокки относятся к грамположительным микроорганизмам. В зависимости от расположения клеток после деления подразделяются на: Микрококки — единично или беспорядочно расположенные кокки, в диаметре не превышают 0,5 мкм. Они являются сапрофитами, обитателями воды, воздуха.

Диплококки — кокки, располагающиеся попарно, делятся в одной плоскости, как результат деления одной особи. Они неподвижны, не образуют спор.

Имеются сапрофитные формы (в почве, водоемах), а также патогенные — пневмококки, менингококки и др.

Стрептококки — (гр. streptos — плетенный, цепь) деление их происходит в одной плоскости и образующиеся клетки не разъединяются, располагаясь цепочками различной длины. Грамположительные кокки, не образующие спор. Подразделяются на патогенные — возбудители многих инфекционных болезней; фекальные (энтерококки) — обитатели кишечника; молочнокислые — встречаются на различных растениях, в молоке, используются для получения молочнокислых продуктов.

Стафилококки — (гр. staphile — виноградная гроздь) делятся в различных плоскостях без особой закономерности, образуя беспорядочное скопление клеток, иногда напоминающее грозди винограда. Грамположительные факультативные анаэробы не образующие спор являются возбудителями (чаще всего St. aureus) различных гнойно-воспалительных процессов (абсцессов,

флегмон, фурункулов, карбункулов, остеомиелитов, гнойных плевритов, ангин, сепсиса, маститов и др.), пищевых токсикоинфекций и т. д.

Тетракокки — сочетание шаровидных микробов по четыре, деление у которых происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях.

Сарцины (гр. sarcio — соединяю) — кокки, соединенные в виде пакетов в результате деления клеток в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Среди них болезнетворных видов не обнаружено.

Палочковидные бактерии. Самая многочисленная и разнообразная группа. Палочковидные микроорганизмы подразделяются на бактерии, бациллы и клостридии. Величина палочковидных форм колеблется от нескольких долей микрометра до 10–15 мкм и более. Различают короткие, длинные, тонкие и толстые палочки. Концы у них иногда закруглены, резко обрублены. Некоторые палочковидные бактерии имеют разветвленную (микобактерии) или овоидную форму, характерную для пастерелл. Они могут располагаться одиночно или беспорядочно, группироваться попарно (диплобактерии, стрептобациллы). Встречаются как сапрофитные, так и патогенные виды.

Бактерии — имеют цилиндрическую форму и не образуют спор. Различают палочки, образующие споры. Среди спорообразующих существуют собственно бациллы и клостридии.

Бациллы — спорообразующие палочки, по типу дыхания аэробы, т. е. для своего развития нуждаются в свободном молекулярном кислороде. Грамположительные, образующие при неблагоприятных условиях (вне организма) споры. Диаметр споры меньше ширины клетки. Большинство из них сапрофиты, некоторые служат возбудителями болезней, напр. Bac. antracis.

Клостридии — спорообразующие палочки, по типу дыхания анаэробы, диаметр споры превышает ширину микробной клетки. Поэтому в процессе спорообразования клостридии изменяют свою конфигурацию.

Термин «клостридии» происходит от греческого слова closter — «веретено». Они являются возбудителями клостридиозов: эмфизематозного карбункула, злокачественного отека, брадзота, столбняка, ботулизма и др.

Извитые формы. Это тонкие бактерии, тело которых спиралевидно изогнуто. Извитые бактерии разделяются на вибрионы, спириллы и спирохеты. По величине бактерии бывают крупные (более 4 мкм), средние (1–4 мкм) и мелкие (0,5 мкм).

Вибрионы — имеют форму запятой или летящей чайки, поворот тела вокруг оси не превышает четверти оборота. Они могут встречаться в различных таксономических группах (возбудители кампилобактериоза сельскохозяйственных животных и холеры человека).

Спириллы — характеризуются небольшим числом крупных завитков (не более пяти). Передвигаются с помощью жгутиков. Грамотрицательные, подвижные, факультативные — аэробы.

Спирохеты — имеют штопорообразную форму с большим количеством завитков. Грамотрицательные активно подвижные микроорганизмы. На конце тела пучком расположены жгутики.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с бактериологической лабораторией, ее основным оборудованием, правилами техники безопасности.

Задание 2. Изучить устройство светового микроскопа, принципы иммерсионной и темнопольной микроскопии.

Задание 3. Провести микроскопию готовых окрашенных препаратов, определить и зарисовать формы микроорганизмов.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Принцип работы с иммерсионной системой.

2. Основные морфологические признаки бактерий.

3. Каковы основные правила работы в микробиологической лаборатории.

4. Окуляр и другие оптические части микроскопа, определение степени увеличения микроскопа.

5. Какими составными частями представлен осветительный аппарат и их назначения.

6. Назначение и правила работы с макро- и микрометрическими винтами.

7. Назначение микроскопа при люминесцентной микроскопии.

8. Какие группы шаровидных бактерий различают по их расположению?

9. На чем основано деление бактерий на собственно бактерии, бациллы и клостридии?

10. Какие морфологические группы имеются среди извитых форм?

Глава 1.2. Приготовление, фиксация и окраска препаратов. Микробиологические краски. Простые и сложные методы окрашивания микроорганизмов (по Граму, по Цилю–Нильсену)

1.2.1. Цель занятия

Овладеть методикой приготовления мазка-препарата для микроскопии из микробной взвеси. Приготовить, окрасить (фуксином или метиленовой синькой) и зарисовать препараты из микробных культур. Отработать методику простого и сложных методов окраски приготовленных препаратов.

1.2.2. Материалы и оборудование

Рабочие растворы красок, спирт ректификат 96%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, окрашенные препараты стрептококка и диплококка, таблица — морфология микробов.

1.2.3. Теоретический материал

Приготовление бактерийных препаратов для микроскопирования

Для обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале и изучения их тинкториально-морфологических свойств, необходимо приготовить препараты, окрасить их и изучить под микроскопом.

Препараты для микроскопирования готовят на предметных стеклах. Материалом служат взвеси бактериальных культур, выросших на питательных средах, молоко, мясо. Из таких материалов готовят препараты-мазки. Из тканей различных органов — препараты-отпечатки.

Предметные стекла, используемые при этом, должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Стекла хранят в банках с притертыми пробками в смеси из равных частей этилового спирта и эфира или в 96,6% спирте ректификате. Возможно, обезжиривание предметных стекол кусочком мыла.

Нанесение микробной взвеси на стекло производят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Бактериологические петли готовят из платиновых или нихромовых нитей в виде замкнутой петли, диаметром 2–3 мм.

Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов:

1. Обезжиривание предметного стекла.

2. Приготовление мазка.

3. Высушивание препарата.

4. Фиксация мазка.

5. Окраска мазка.

В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.

Обезжиривание предметного стекла. Стекла, не бывшие в употреблении, сначала моют в воде, затем выдерживают в смеси спирта-эфира, фламбируют над пламенем горелки — это и есть обезжиривание. Новые стекла можно готовить путем кипячения 10 мин в 1% растворе натрия гидрокарбоната (соды), промывания в дистиллированной воде с добавлением 0,5% соляной кислоты с целью нейтрализации и окончательного споласкивания в дистиллированной воде.

Приготовление мазка. Для приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде, на обезжиренное предметное стекло наносят бактериологической петлей небольшую каплю стерильного физиологического раствора. Затем петлю прокаливают до красна (стерилизуют фламбированием), внося ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего из пробирки с культурой вынимают пробку захватывая ее мизинцем и ладонью правой руки (рис. 1.2.3.1.).

Пробирку с культурой следует держать левой рукой, пробкой к себе. Вынув пробку, края пробирки обжигают и вносят в нее бактериологическую петлю. Прежде чем захватить небольшое количество культуры, петлю охлаждают, касаясь стенок пробирки. Петлю с культурой осторожно вынимают, еще раз обжигают края пробирки, а культуру вносят в приготовленную ранее каплю физраствора, тщательно размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого овала или круга (1,5–2 см в диаметре). По окончании приготовления мазка петлю вновь прокаливают.

Рис. 1.2.3.1. Схема приготовления препарата-мазка

Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло петлей 1–2 раза наносят исследуемый материал и равномерно распределяют.

Приготовленный препарат высушивают на воздухе, просохший мазок фиксируют.

Пастеровскими пипетками делают мазки из жидкостей и бульонных культур. Пипетка должна быть стерильной. Над пламенем горелки отламывают запаянный конец и набирают материал. После нанесения капли культуры на предметное стекло и ее распределения пипетку отпускают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Мазок высушивают при комнатной температуре.

Фиксация мазка. Фиксацию мазка проводят физическим и химическим способами.

Физический способ фиксации — над пламенем горелки. Для этого предметное стекло с мазком берут большим и указательным пальцами или пинцетом и проводят 3–4 раза над пламенем горелки, каждый раз, прикладывая стекло к коже руки. Ощущение жжения свидетельствует о том, что мазок фиксирован. При этом бактерии погибают, плотно прикрепляясь к стеклу. Этот способ нельзя применять при исследовании клетки.

Химический способ используют для фиксации мазков из крови и мазков-отпечатков, так как при действии высоких температур разрушаются клеточные элементы. При этом препараты погружают в фиксирующую жидкость: в метиловый спирт — на 5 минут, в этиловый спирт — на 10 минут, ацетон — 5 минут, смесь Никифорова (равный объем спирта и эфира) — на 15 минут.

Цель фиксации:

1) Закрепить бактерий на стекле.

2) Умертвить микробные клетки, обезопасив себе работу.

3) Коагулировать белок клетки, после чего она лучше воспринимает краситель.

Окраска мазка

В микробиологической практике для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:

— синие — метиловый синий, водный синий, опаловый синий;

— красные — фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый;

— фиолетовые — метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет;

— зеленые — малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый;

— желто-коричневые — хризоилин, везувин.

При простом методе окраски применяют только один краситель. Раствором краски покрывают охлажденный фиксированный мазок, выдерживают 2–5 минут, краску сливают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией. Этот способ окраски позволяет обнаружить в материале микроорганизмы и дать некоторые представления об их морфологии.

При сложных методах окрашивания применяют несколько растворов красителей и реактивов. Они основаны на физико-химических различиях состава микробных клеток. Эти методы позволяют помимо морфологии бактерий, определить их тинкториальные особенности (различное окрашивание при использовании специальных методов) и наличие или отсутствие структурных элементов клетки (капсула, спора), что имеет важное дифференциально-диагностическое значение. Химический состав и строение клеточной стенки микробов различны, поэтому они окрашиваются одними и теми же красителями по-разному и неодинаково отдают их при последующем обесцвечивании этиловым спиртом, кислотами и другими реактивами. Части микробной клетки избирательно реагируют на красящие растворы. На этом свойстве основаны сложные (дифференциальные) методы окрашивания микробов. Для сложного окрашивания используют несколько красителей. В лабораторной практике применяют методы Грама, Циля–Нильсена, Козловского и др.

Окраска по Граму

Метод Грама (модификация по Синеву). Этот метод позволяет все микроорганизмы разделить на две группы: грамположительные (Гр⁺) и грамотрицательные (Гр–).

На фиксированный мазок помещают:

1. Кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной 1%-ным спиртовым раствором генцианвиолета. Наносят на бумажку 2–3 капли воды и окрашивают 2–3 минуты. Бумагу снимают, мазок не промывают.

2. Наносят раствор Люголя на 2 минуты, смывают водой.

3. Обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом в течение 20–30 секунд и тщательно смывают мазок водой.

4. Докрашивают мазок фуксином в течение 2–3 мин и промывают водой.

5. Высушивают на воздухе и микроскопируют.

Микроскопическая картина: грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в розовый.

Окраска микроорганизмов по этому методу зависит от химического состава клеточной стенки (наличие муреина и частично липида), цитоплазмы и pH среды.

Окраска по Цилю–Нильсену

На фиксированный мазок наносят небольшой кусок фильтровальной бумаги, на него наносят раствор карболового фуксина, снизу препарат подогревают над пламенем горелки до появления паров и оставляют на «мостике» 5–7 минут. Затем краску с бумагой убирают (не промывая). Наносят 3–5% раствор серной кислоты, окрашивают 5–7 минут, хорошо промывают водой. Затем добавляют раствор метиленовой сини (по Леффлеру), окрашивают 4–5 минут. Препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: кислото-спиртоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), некислотоустойчивые — в синий (окрасившись первоначально фуксином в красный цвет, легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают дополнительную окраску метиленовой сини).

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур.

Задание 2. Окрасить препараты простым методом (фуксином или метиленовой синькой) и по Граму, зарисовать.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Красители, применяемые в микробиологии.

2. Способы и цели фиксации.

3. Порядок приготовления препарата для микроскопии и простой метод окраски.

4. Методика приготовления мазка.

5. Способы обработки предметных и покровных стекол.

6. Какие существуют методы фиксации?

7. Чем обуславливается различное окрашивание бактерий по Граму?

9. Каково действие спирта при окрашивании по Граму?

10. Какова особенность окраски по Цилю-Нильсену?

Глава 1.3 Методы окрашивания спор и капсул. Исследование бактерий на подвижность

1.3.1. Цель занятия

Овладеть методами окрашивания препаратов на капсулы и споры. Приготовить, окрасить и зарисовать препараты из микробных культур на споры. Освоить методики определения подвижности микроорганизмов

1.3.2. Материалы и оборудование

Рабочие растворы красок, спирт ректификат 96%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, окрашенные препараты на капсулы, таблицы и рисунки спор и капсул микробов.

1.3.3. Теоретический материал

Окраска спор

Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву.

Окраска спор по Златогорову. На фиксированный мазок наносят:

1. Карболовый фуксин, окрашивают 5–10 мин

2. 2% раствор серной кислоты, выдерживают 2–3 сек.

3. Раствор метиленовой сини, окрашивают 3–5 мин

Микроскопическая картина: споры красного цвета, вегетативные формы — синие.

Окраска капсул

Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой.

Капсула — слизистый слой оболочки, муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, который синтезируется в цитоплазме и секретируется на поверхности клеточной стенки (является производным наружного слоя оболочки).

Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Размеры их чаще превышают тело микробной клетки. Химический состав капсул неоднородный: одни из них состоят из комплекса белков, другие — из полисахаридов. Капсула и остальная часть клетки окрашиваются неодинаково: первая как бы выполняет роль защиты и часто встречается у патогенных микроорганизмов.

Существует несколько методов окрашивания капсул.

Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:

1. Мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется.

2. Фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метахромотические краски, при использовании которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула — в другой;

3. Промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.

Окраска капсул по Михину. На фиксированный мазок наносят:

1. Метиленовый голубой Леффлера (лучше старый раствор), окрашивают 2–3 мин, при подогревании.

2. Смывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тела микробных клеток темно-синего цвета, капсулы — светло-розового.

Окраска капсул по Ольту. На фиксированный мазок наносят:

1. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина, окрашивают 5–7 минут.

2. Быстро промыть водой и высушивают.

Микроскопическая картина: тело клетки окрашивается в красно-кирпичный цвет, капсула — в желто-оранжевый.

Определение подвижности микроорганизмов

У подвижных видов органами передвижения являются жгутики, которые осуществляют вращательные движения. Расположение их на теле микробной клетки различное. Жгутики бывают различной длины. Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии.

В зависимости от расположения и количества жгутиков микроорганизмы подразделяют на:

а) монотрихи — микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик. Это самые подвижные бактерии, движения активные, поступательные (псеудомонас);

б) лофотрихи — микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков, движения активные, поступательные (листерии);

в) амфитрихи — микроорганизмы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки, передвигаются беспорядочно;

г) перитрихи — микроорганизмы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки, передвигаются беспорядочно (кишечная палочка).

Рис. 1.3.3.1. Типы расположения жгутиков у бактерий

Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться. Исследование проводят путем приготовления висячей или раздавленной капли.

Метод «висячая капля». Висячую каплю готовят на предметном стекле с углублением (луночкой). Край луночки смазывают тонким слоем вазелина и наносят на покровное стекло микроорганизмы. Если они выращены в жидкой среде, берут каплю такой культуры, если на плотной, то сначала на покровное стекло наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида, а затем культуру микробов. Предметное стекло проворачивают на 180° и аккуратно опускают на покровное так, чтобы капля оказалась в центре углубления, после чего его возвращают в прежнее положение. В таком препарате капля подвешена с внутренней поверхности покровного стекла и находится в герметически закрытой влажной камере Это позволяет наблюдать за движением микробов в течение длительного времени. Препарат рассматривают в слегка затемненном поле (диафрагму сужают), что увеличивает контрастность неокрашенных форм.

Метод «раздавленная капля». Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур.

Задание 2. Окрасить препараты на споры по методу Златогорова, зарисовать.

Задание 3. Определить подвижность предложенных культур микроорганизмов методами «висячая» и «раздавленная капля».

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какова особенность окраски препаратов на споры?

2. Какие применяют методы окрашивания капсул?

3. Как исследуют микроорганизмы на подвижность?

Глава 1.4. Питательные среды для культивирования микроорганизмов. Приготовление основных питательных сред. Техника посева

1.4.1. Цель занятия

Освоить основные методики приготовления искусственных питательных сред, наиболее широко применяемых в лабораториях.

Изучить способы посевов и пересевов микроорганизмов на питательные среды. Произвести посев культур микробов на МПБ и МПА (в пробирки), а также посев смеси микробных культур (для выделения чистых) методом рассева на чашки Петри с МПА. Ознакомиться с аппаратом для культивирования микроорганизмов (термостатом).

1.4.2. Материалы и оборудование

Компоненты для приготовления питательных сред: агар-агар, желатина, пептон, х. ч. NaCl, колбы с мясной водой, раствор 8–10%-ный KOH, воронки, гигроскопическая вата, марля, фильтровальная бумага, градуированные пипетки различной емкости, дистиллированная вода, стерильные пробирки с ватными пробками, компаратор, электроплитки. Готовые сухие среды.

Пробирки с культурами микроорганизмов, смесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия из культур Вас. rasentericis, Bac. mycoidis, Sarcina flawa, Sarratia marcescens, которую готовят перед посевом. Пробирки с МПА и МПБ для каждого студента, стерильные чашки Петри, микробиологические петли, иглы, шпатели, карандаши по стеклу, спиртовки, спички. Таблица: схема посева микроорганизмов на питательные среды.

1.4.3. Теоретический материал

Требования к питательным средам

Основные требования предъявляемые к питательным средам:

1. Стерильность и по возможности прозрачность;

2. Содержание необходимых для жизнедеятельности клеток биохимических факторов — источников энергии, углерода, азота, серы, а также неорганических ионов — обязательно в форме, доступной для усвоения микроорганизмами;

3. Оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (рН), окислительно-восстановительного потенциала (Еh), активности воды (аw) осмотического давления.

Классификация питательных сред и способы их приготовления

Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава. В зависимости от химического состава и исходных компонентов различают следующие типы питательных сред.

Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на:

1. Среды животного происхождения (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко и т. д.);

2. Среды растительного происхождения (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т. д.).

Некоторые продукты используют в натуральном виде (картофель, морковь, молоко и т. д.), но чаще животные и растительные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу).

Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соотношении. Питательные синтетические среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных сред, например при получении диагностических аллергенов, или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том или ином конкретном химическом соединении.

По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы из исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные среды. Необходимую консистенцию среде придают добавлением различных уплотнителей.

Агар-агар (малайское желе) — полисахарид, продукт переработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80–86 °C, затвердевает при 40 °C. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5–2%, реже 3%; полужидких — 0,3–0,7%.

Желатина — экстракт из тканей, содержащих много коллагена (кости, хрящи, сухожилия и т. д.). Желатиновый гель плавится при 25 °C, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37–38 °C. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10–20% желатины.

По целевому назначению различают общеупотребительные (основные), обогащенные, специальные, элективные (избирательные) и питательные дифференциально-диагностические среды.

Общеупотребительные (основные) среды. Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов.

В качестве исходных компонентов для приготовления основных сред используют наиболее часто мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.

Мясная вода: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш заливают водопроводной водой в соотношении 1:2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при 120 °C 20 мин

Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия мелко нарезают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45 °C и добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия до рН 7,8–8,0, встряхивают и добавляют хлороформ (10 мл/л), плотно закрывают, выдерживают в теплом месте 10 дней, получают продукт гидролиза (перевар).

Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия, устанавливают необходимый рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120 °C 15–20 мин

Мясо-пептонный агар (МПА): к МПБ добавляют 2–3% промытого мелко нарезанного агар-агар, нагревают до расплавления агара, доводят до кипения, в горячем виде проверяют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значения (7,2–7,6), фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Профильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм. 20–30 мин Чтобы получить скошенную поверхность агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят).

Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандартной чашки Петри около 10 см, выпускают чашки меньшего и большого диаметров, а также одноразовые пластиковые стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки наливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45–50 °C питательного агара, чашки помещают на горизонтальную поверхность до застывания агара.

Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25% агара. Кипятят при помешивании до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2–7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ): к МПБ добавляют 10–20% измельченной желатины, нагревают до расплавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2–7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112 °C при 15 мин

Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1:5 (1:8) до содержания аминного азота 120 мг%, добавляют 1,5% хлорида натрия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4–7,6, кипятят 15–20 мин, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °C 20–30 мин

Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хоттингера 2% агар-агара.

Предприятия биологической промышленности выпускают готовые питательные бульоны и агар в виде сухого порошка.

Питательный бульон содержит (г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05, хлорид натрия — 4,95. Навеску порошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют в автоклаве при 120 °C 20 мин (рН 7,3).

Питательный агар содержит (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей — 12,0; агар — 12,5; хлорид натрия — 5,5. Навеску порошка массой 36 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят 3 мин, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют при температуре 120 °C 20 мин (рН 7,3).

Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, поэтому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т. д. Такие питательные среды получили название обогащенных.

Сывороточный и кровяной агары: к расплавленному и охлажденному до 45–50 °С стерильному питательному агару добавляют 5–10% стерильной дефибринированной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, КРС, кролика). Для получения дефибринированной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стеклянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15–20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах. Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, пробирки и оставляют до застывания питательной среды.

Сывороточный и кровяной бульоны готовят аналогичным образом.

Растворы углеродов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5–1% к питательной среде.

Специальные среды. Так называют среды, разработанные с учетом специфических ростковых потребностей ряда бактерий. Например, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др.

Среда Мак-Коя: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0–7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4–5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертывания сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75 °C 1 ч, на второй день при 85 °C 30 мин Для контроля стерильности приготовленные среды выдерживают 2 сут в термостате при 37–38 °C.

Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсена и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсека: раствор А: гидрофосфат натрия — 11,876 г, вода дистиллированная — 1000 мл; раствор Б: дигидрофосфат калия — 9,078 г, вода дистиллированная — 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и добавляют объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм. 20 мин В каждую пробирку добавляют шесть–восемь капель стерильной инактивированной при 56 °C сыворотки кролика.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) Китта-Тароцци. Предварительно готовят печеночную воду: печень крупного рогатого скота промывают, очищают и нарезают мелкими кусочками, заливают водой 1:1, кипятят, фильтруют, стерилизуют. Полученную печеночную воду смешивают с МПБ 2:1 (на 2 л МПБ + 1 л печеночной воды). Кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам (по 8–10 мл). Перед разливом среды в пробирки кладут кусочки вареной печени, сверху среду заливают 1–2 мл вазелинового масла, стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин

Бульон и агар Мартена. Для приготовления сред Мартена используют продукты переварения свиных желудков (или сычуга рогатого скота). Желудки очищают от жира, фасций, измельчают в мясорубке и заливают водой 1:4 с добавлением к общему объему жидкости 1% соляной кислоты. Смесь выдерживают сутки при 50 °C, нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH до щелочной реакции (посинение лакмусовой бумажки), автоклавируют при 120С 15 мин Затем смешивают равные количества полученного перевара и мясной воды, кипятят 10 мин, подщелачивают 20%-ным NaOH до рН 7,9, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, колбам и автоклавируют при 0,5 атм. 30 мин Для приготовления плотной среды к полученному бульону Мартена добавляют 2–3% агара, определяют рН, фильтруют, как обычный МПА, стерилизуют при 0,5 атм. 30 мин

Элективные среды. От латинского Electus — избранный. Это питательные среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразно по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественно рост искомого микроорганизма и (или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции.

Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. К расплавленному МПА с рН 7,2–7,4, содержащему 5–7,5% хлорида натрия, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока, перемешивают и разливают в чашки Петри.

Среда Шустовой предназначена для выделения сальмонелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10% к объему среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2% раствора Люголя.

Среда Раппопорт предназначена для культивирования сальмонелл. К МПА добавляют 1% глюкозы, 10% желчи, 1% индикатора Андрэдэ. Стерилизуют текучим паром.

Среда Мюллера предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90 мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120 °C 30 мин Затем стерильно добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия — 50 г, дистиллированная вода — 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин

Среда Кауфмана — это среда обогащения для сальмонелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1:1000, и 5 мл стерильной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин

Казеиново-угольный агар (КУА) с пенициллином используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дистиллированной воды добавляют гидролизат казеина — 20 мл, хлорид натрия — 5 г, хлорид калия — 0,2 г, хлорид кальция — 0,002 г, карбонат натрия — 0,4 г, хлорид магния — 0,025 г, гидрофосфат калия — 0,24 г, растворимый крахмал — 1 г, цистин — 0,01 г, агар — 20 г. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 амт 30 мин Перед употреблением в расплавленный агар (50 °C) добавляют 3% дрожжевого экстракта и 0,2% сухого активированного угля и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри.

Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции могут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатора, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата. К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др.

Среду Гисса используют для изучения ферментативных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл дистиллированной воды добавляют 1% пептона, 0,5 г хлорида натрия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0–7,4, добавляют один из углеводов-субстратов (лактоза, глюкоза и т. д.), агар-агар (0,3–0,4%), а затем 1 мл индикатора Андрэдэ или 0,1 мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112 °C 20 мин Выпускают сухие среды Гисса с индикатором ВР — смесь водно-голубого с розоловой кислотой (готовые среды — полужидкой консистенции).

Плотные дифференциально-диагностические среды применяют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их состав нередко кроме известного субстрата входят вещества, придающие питательной среде селективные свойства.

Среда Эндо содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу. К 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70 °C добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной кипяченной воды. В отдельных пробирках готовят: 2–3 мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10%-ного водного раствора сульфата натрия. В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и добавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, перемешивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, среда закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и колония микроорганизма, например эшерихий, приобретает красный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед употреблением определенную навеску порошка вносят в дистиллированную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри.

Среда Левина. Аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метиленовым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2–7,4) добавляют 2 мл 0,5%-ного водного раствора метиленового синего, 1,5 мл 2%-го раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин Лактозу и дигидрофосфат калия предварительно разводят в небольшом количестве стерильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопозитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-черный цвет.

Агар Плоскирева предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпускают в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой основы входят: желчные соли, цитрар натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, хлорид натрия, дактоза, нейтральный красный. Навеску порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розовая. Колонии сальмонелл бесцветные, эшерихий — брусничного цвета.

Сухой висмут-сульфит — агар: МПА, содержащий циртат висмута, сульфит натрия, дифосфат натрия, соль Мора, бриллиантовую зелень, глюкозу, кальцинированную соду. 6 г сухого вещества разводят в 100 мл дистиллированной воды, охлаждают до 50 °C, осторожно взбалтывают, разливают по чашкам Петри. Застывший агар подсушивают в термостате.

Молоко (обезжиренное) — естественная среда животного происхождения. Молоко слегка подщелачивают добавлением 1%-ной двууглекислой соды, проверяют реакцию лакмусовой бумажкой — легкое посинение ее свидетельствует о слабощелочной реакции молока. Фильтруют, разливают в стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром дробно.

Растительные питательные среды. Готовят картофельные среды, морковные, гороховые, капустные и др.

Картофельные среды (ломтики или картофельная кашица). Вымытый картофель очищают от кожуры и глазков, нарезают ломтиками цилиндрической формы, затем их разрезают по диагонали на две части (чтобы была плоская поверхность для посева бактерий), погружают в 1%-ный раствор двууглекислой соды на 1–2 ч, затем просушивают фильтровальной бумагой и помещают в специальные пробирки с перетяжкой в ее нижней трети (пробирки Ру). На дно пробирки до перетяжки наливают 5%-ную глицеринизировнную воду. Стерилизуют при 120 °C 20 мин

Среды из кашицеобразного картофеля и из гороха наибольшее применение нашли в биологической промышленности. Процесс приготовления этих сред сложный, длительный. В диагностической бактериологической работе применяют очень редко.

Синтетические среды. Готовят из химически чистых, растворимых в воде веществ в строго определенных количествах — различных солей, углеводов, витаминов и др. Синтетические среды готовят жидкие, полужидкие и плотные.

Среда Ван-Интерсона (для выращивания дрожжей и плесневых грибов) содержит азоткислый аммоний (NaH₄NO₃) — 0,5 г, калий фосфорнокислый однозамещенный (KH₂ PO₄) — 0,5 г, растворенные в 1 л водопроводной воды. Стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20 мин. Для культивирования грибов широко используют также глюкозный агар Сабуро (в 100 мл воды растворяют 4 г глюкозы, 1 г пептона, 1,8 г агара, автоклавируют при 0,5 атм. 20–30 мин) и агар Литмана (с бычьей желчью) — на 1 л воды — 10 г пептона, 10 г глюкозы, обезвоженной желчи крупного рогатого скота 15 мл, кристаллвиолета 0,01 г, агара 20 г. Стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °C 15 мин Разливают в чашки Петри толстым слоем.

1.4.4. Культивирование микроорганизмов

Микроорганизмы выращенные в лабораторных условиях, называют микробными культурами. Для получения культуры из исследуемого материала (кровь, эмульсия тканей, отечная жидкость, гной, молоко и др.) его высевают на стерильные питательные среды в пробирках, колбах или чашках Петри и помещают на определенное время в специальные шкафы — термостаты, где постоянно поддерживается необходимая температура. Температурный режим для разных групп микроорганизмов неодинаковый — 37–38, 26–30 и 22–25 °C. В условиях большого объема работы (биофабрики) имеются термостатные комнаты.

Выращивание микроорганизмов на естественных и искусственных питательных средах проводят по оптимальной температуре. Поддерживать постоянную температуру в течение длительного времени можно в специальных аппаратах — термостатах. Они могут быть водяного и воздушного обогрева. В современных термостатах источником энергии является электричество. Широкое распространение получили суховоздушные термостаты с теплорегулирующим устройством повышенной точности.

Культивирование анаэробов. Анаэробы растут без свободного кислорода воздуха, т. к. образующийся пероксид водорода (Н₂О₂) окисляет цитоплазму и вызывает гибель микробной клетки. Анаэробы не образуют каталазу, способную разрушать пероксид водорода. Создание условий с пониженным содержанием кислорода в воздухе окружающей среды достигается различными методами.

Физический метод. Анаэробиоз создается путем механического удаления воздуха с помощью вакуум-масляного насоса. Эксикатор с посевами через манометр соединяют с насосом, с помощью которого отсасывают воздух. После закрытия крана и отсоединения эксикатора его вместе с посевами ставят в термостат для культивирования.

Химический метод. Основан на поглощении кислорода воздуха химическими веществами. Посевы с такими соединениями (пирогаллол и 10% раствор гидроксида натрия) помещают в герметически закрывающийся сосуд и ставят в термостат.

Биологический метод. Анаэробы и аэробы выращивают вместе. Для этого плотную питательную среду (МПА) в чашке Петри делят на 2 части, путем удаления узкой полоски среды. На одну из них высевают аэробы, на другую — анаэробы. После заливки краев чашки Петри парафином, ее ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, создающие благоприятные условия для развития анаэробов.

Комбинированный метод. Анаэробиоз создается путем одновременного или последовательного сочетания нескольких методов. Принцип этого метода основан на использовании среды Китта–Тароцци (МППБ). Среда представляет собой печеночный бульон, разбавленный трехкратным количеством мясопептонного бульона с кусочками мелко нарезанной печеночной, почечной или мышечной ткани. Сверху на среду наливают индифферентное вазелиновое масло. Для удаления газов, в том числе кислорода, среду перед применением нагревают до кипения на водяной бане.

Способы посева и пересева микроорганизмов на питательные среды

Микроорганизмы размножаются на питательных средах. Посев микробов осуществляют микробиологической петлей или иглой и пастеровскими пипетками. Пипетки перед применением стерилизуют в паровом стерилизаторе, тонкие концы их запаивают. Внутрь широкого конца пипетки, с которым соприкасаются губы исследователя, вставляют кусочек стерильной ваты, препятствующей попаданию материала в ротовую полость.

1.4.5. Техника посева

Петлю или пипетку держат в правой руке, пробирку — в левой. Пробирку мизинцем правой руки прижимают к ладони, и после извлечения держат в руке. Петлю вводят в пробирку, материал на плотной среде распределяют зигзагообразно, а в жидкой — вращательным движением. При пересеве из одной пробирки в другую петлю после введения внутрь охлаждают, затем берут культуру и извлекают из пробирки так, чтобы она не прошла над пламенем спиртовки.

Для посева уколом в пробирку с МПА столбиком необходимо иметь микробиологическую иглу, беспрепятственно проходящую в глубь питательной среды. На пути прохождения иглы остаются микробы, которые могут расти по уколу.

При посеве в бульонную культуру петлей касаются дна пробирки.

Пастеровскими пипетками берут жидкий материал или культуру, выращенную на жидкой питательной среде. Перед этим пипетку проводят над пламенем спиртовки, стерильным пинцетом отламывают запаянный конец, набирают материал и переносят на питательную среду. Пробирку закрывают над пламенем, а пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью. На пробирках или чашках пишут дату, название органа или культуры, номер акта экспертизы, при проведении научных исследований делают другие пометки. Затем пробирки помещают в термостат для культивирования.

Для выделения чистой культуры из микробной смеси или материала готовят разведения на изотоническом растворе натрия хлорида и только после этого делают посев на плотную питательную среду в чашки Петри. Петлей или пипеткой на плотную питательную среду наносят каплю смеси, и легкими движениями шпателем распределяют ее по всей поверхности. Для того, чтобы получить изолированные колонии, внесенную каплю нужно распределить на поверхности среды в нескольких чашках, перенося шпатель из первой во вторую, из второй в третью и т. д.

Шпатель обычно изготавливают из стеклянной палочки в виде треугольника на одном конце, или из тонкой металлической проволоки. Предпочтительнее первый, так как при распределении смеси он легко скользит по поверхности среды. Крышку во время посева открывают по направлению к пламени спиртовки. После посева шпатель фламбируют и ставят в штатив. Чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат. В этом положении исключается возможность слияния колоний (при небольшом количестве они будут находиться на некотором расстоянии друг от друга, изолированно). Затем производят посев материала в пробирки на МПБ и МПА, а также смесь культур на МПА в чашки Петри.

В чашку Петри вносят питательную среду, для чего МПА столбиком расплавляют на водяной бане. Содержимое пробирок выливают в чашки Петри и над пламенем горелки плавными вращательными движениями равномерно распределяют по всей поверхности дна чашки.

Первый студент делает посев на одну чашку, которую со стороны дна делит на 3 сектора и соответственно обозначает цифрами I, II, III. В первый сектор петлей вносят каплю культуры, шпателем смесь сначала распределяют в одном секторе, затем переносят его во второй и третий сектора чашки. Второй студент делает посев на две чашки. Микробную смесь вносят в первую чашку и распределяют шпателем, затем этот же шпатель переносят во вторую чашку. Все чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат. Так можно получить изолированные колонии и выделить культуру в чистом виде.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Приготовить основные (общеупотребительные) среды.

Задание 2. Приготовить растительные среды.

Задание 3. Провести пересев бульонной и агаровой культур бактерий на скошенный МПА и в МПБ в пробирках.

Задание 4. Провести посев смешанной бульонной культуры на МПА в чашках Петри по методу Дригальского.

Задание 5. Описать характер роста E. coli, S. aureus, B. cereus на МПА (колонии) и на МПБ.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. В чем отличие МПБ, бульона Мартена, бульона Хоттингера?

2. Назначение специальных, дифференциально-диагностических и селективных питательных сред?

3. Что называют культурой микроорганизмов?

4. Что следует понимать под названием культивирование микроорганизмов?

5. Устройство и назначение термостата и терморегуляторов

6. Методы создания анаэробиоза.

7. Какие среды называются элпективными, их назначение и применение?

8. Какие существуют методы культивирования микроорганизмов?

9. Какова техника посева микробов на плотных, жидких и полужидких питательных средах?

Глава 1.5. Культуральные свойства микроорганизмов

1.5.1. Цель занятия

Ознакомить студентов с основными культуральными характеристиками микроорганизмов.

1.5.2. Материалы и оборудование

Бульонные и агаровые культуры B.cereus, E.coli и S.aureus в пробирках и чашках Петри.

1.5.3. Теоретический материал

Культуральные свойства микроорганизмов

В процессе идентификации наряду с другими свойствами у микроорганизмов изучают культуральные признаки — особенности роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах при определенных условиях.

На плотных средах изучают колонии микроорганизмов. Бактерии каждого вида формируют колонии с определенными признаками, которые обычно учитывают при идентификации.

Размер колоний: крупные — диаметром 4–6 мм и более, средние — 2–4 мм, мелкие — 1–2 мм и точечные колонии диаметром менее 1 мм.

Форма колоний может быть правильной круглой, неправильной (амебовидной, розеткообразной), корневидной.

Цвет зависит от способности микроорганизма образовывать пигмент: белый, желтый, красный, сине-зеленый и т. д. Бактерии, не синтезирующие пигмент, формируют бесцветные колонии.

Характер поверхности, которая может быть шероховатой, блестящей, матовой, сухой, влажной, гладкой, радиально или концентрически исчерченной.

Края колонии могут быть ровными, волнистыми, зазубренными, бахромчатыми, их исследуют невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа.

Рельеф (профиль) определяют, рассматривая колонию сбоку; различают плоские, конусообразные, куполообразные, плоские с конусовидным центром или углублением в центре колонии, с утолщенными (валикообразными) краями.

Прозрачность колонии: непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная.

Структура может быть однородной, зернистой, волокнистой и т. д. Ее выявляют при слабом увеличении микроскопа.

Консистенция может быть пастообразной, слизистой, плотной (сухой) и т. д.; ее определяют, дотрагиваясь до колонии бактериологической петлей. Колонии некоторых видов врастают в толщу питательной среды, что также определяют при помощи бактериологической петли.

Запах: многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества.

Ценную дополнительную информацию об особенностях строения колоний дает их изучение в косопадающем пучке света. Культуры на прозрачной агаровой среде в чашках Петри помещают на предметный столик бинокулярной лупы. Между бинокулярной стеклой и источником света помещают зеркало от микроскопа вогнутой стороной вверх таким образом, чтобы лучи, отраженные от него, попадали в плоскость изучаемого объекта под углом 40–45°. Зеркало устанавливают на равном удалении от объекта и источника света (12–14 см). При таком освещении колонии бактерий могут быть окрашены в различные цвета. Цвет зависит как от видовых особенностей, так и от состояния культуры (S-, R-формы).

На жидких средах учитывают следующие признаки:

Степень помутнения среды — интенсивное, среднее, слабое.

Наличие или отсутствие пристеночного кольца на границе мениска и внутренней поверхности пробирки.

Характер поверхностной пленки — толщина, цвет, поверхность.

Характер осадка — обильный, скудный, компактный, хлопьевидный, слизистый. При характеристике осадка пробирку слегка встряхивают и учитывают результат: осадок разбивается в гомогенную равномерную суспензию; образуется мелкие или крупные хлопья, глыбки; слизистый осадок при встряхивании обычно поднимается в виде косички. Пигментообразующие микроорганизмы вызывают окрашивание питательной среды и осадка (желтое, зеленоватое, красное и т. д.).

На полужидких питательных средах изучают отношение микробов к кислороду:

Аэробы — рост в виде «перевернутой елочки».

Анаэробы — рост в виде «нормальной елочки».

Факультативные — рост в виде «ершика».

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Изучить культуральные свойства микроорганизмов на агаровых культурах в чашках Петри.

Задание 2. Определить культуральные признаки на жидких питательных средах.

Задание 3. Ознакомиться с культуральными свойствами на МПЖ и определить аэробиоз.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

2. Что такое колония микробов?

3. Каковы культуральные свойства микроорганизмов на плотных питательных средах?

4. По каким признакам исследуют культуральные свойства микроорганизмов на жидких питательных средах?

5. Каковы особенности культуральных свойств микроорганизмов на полужидких питательных средах?

6. Какие существуют методы культивирования анаэробных форм микроорганимов?

Глава 1.6. Методы стерилизации (физические, химические и биологические)

1.6.1. Цель занятия

Ознакомить студентов с назначением и основными методами стерилизации, применяемыми в микробиологии.

1.6.2. Материалы и оборудование

Автоклав, печь Пастера, аппарат Коха, керамические, асбестовые и мембранные фильтры, чашки Петри, бактериологические пробирки, колбы, мерные пипетки, стерилизатор, шприцы, иглы, пинцеты, вакуумный насос и др.

1.6.3. Теоретический материал

Методы стерилизации

Стерилизация (лат. sterilis — бесплодный) — обеспложивание; уничтожение в каком-либо материале патогенных и непатогенных микроорганизмов в вегетативной и споровой формах. Для стерилизации используют физические и химические методы. Механизмы их действия неодинаковы, но при выборе любого из методов должны быть соблюдены два основных требования: достижение полного обеспложивания и сохранение физико-химических свойств стерилизуемого материала.

Физические методы стерилизации. Методы заключаются в уничтожении микроорганизмов с помощью физических средств. К ним относят: стерилизацию сухим жаром, влажным жаром, фильтрованием, ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком.

Стерилизация сухим жаром включает в себя фламбирование и действие высокой температуры в виде сухого нагретого воздуха.

Фламбирование (прокаливание). Этим методом стерилизуют обычно металлические предметы: бактериологические петли, пинцеты и др.

Стерилизация сухим нагретым воздухом. Метод применяют для стерилизации чистой стеклянной посуды. Для этого используют печь Пастера — специальный сушильный шкаф с двойными стенками. Снаружи он облицован теплонепроницаемым материалом. В его верхной части находится термометр. Между теплонепроницаемой обшивкой и внутренним металлическим корпусом на дне помещен автоматический электронагревательный элемент. При включении электрошкафа в электросеть воздух внутри внего нагревается. По достижении заданной температуры отмечают время начала стерилизации. Режим стерилизации: при температуре 155–160 °C — экспозиция 2 ч, при 165–170 °C — 1–1,5 ч, при 180 °C — 1 ч. По истечении времени стерилизации нагревание прекращают, и лишь когда температура снизится примерно до 45 °C, шкаф открывают.

Нельзя стерилизовать сухим жаром воспламеняющиеся вещества, питательные среды, резиновые предметы.

Стерилизация влажным жаром также включает в себя ряд методов.

Кипячение. Общепринятый метод стерилизации металлических инструментов (шприцев, игл, пинцетов, ножниц, скальпелей и др.), некоторых резиновых и стеклянных предметов, которые складывают в стерилизаторы — специальные металлические ванночки с крышкой и вставной решеткой — подставкой. Эту подставку выстилают двумя-тремя слоями марли или тонким слоем гигроскопической ваты. Шприцы стерилизуют в разобранном виде, в иглы вставляют мандрены. Режущие инструменты — лезвия скальпелей, ножниц обертывают марлей или ватой. В стерилизатор наливают воду (лучше стерилизованную) так, чтобы она полностью покрывала инструменты, и добавляют 2%-ный раствор гидрокарбоната натрия. Стерилизатор закрывают крышкой. Кипятят 20–30 мин После стерилизации воду осторожно сливают, а инструменты используют только после их охлаждения.

Дистиллированную воду или приготовленный физраствор стерилизуют ex tempore на небольшом огне в колбе. Колбу закрывают ватной пробкой и помещают на асбестовую подставку.

Стерилизация текучим паром. Этим методом стерилизуют питательные среды и другие материалы и вещества (желатина, углеводы), которые разрушаются при нагревании их свыше 100 °C. Способ дробной стерилизации при температурных режимах не выше 100 °C был разработан Тиндалем (1877). Однократное прогревание убивает только вегетативные формы микроорганизмов. Оставшиеся жизнеспособными споры бацилл в периоды между стерилизацией прорастают в вегетативные формы. Стерилизация на следующий день вызывает их гибель. На третий день прогревание гарантирует полное обеспложивание материала. Эффективность дробной стерилизации зависит от прорастания спор, а поэтому в промежутках между нагреванием материалы выдерживают при комнатной температуре (оптимум 25 °C). для стерилизации используют текучепаровой аппарат Коха — одностенный металлический котел цилиндрической формы с двойным дном и крышкой с отверстиями для термометра и выхода пара. На дно аппарата наливают воду до уровня, о котором судят по показанию водомерной трубки. Началом стерилизации считают момент закипания воды. Образующийся пар устремляется вверх непрерывной струей, соприкасаясь с обрабатываемым материалом. Стерилизуют при 100 °C 30–40 мин три дня подряд. Дробную стерилизацию при 100 °C можно проводить в автоклаве, закрытом негерметично, при тех же режимах.

Тиндализация. Это дробная стерилизация при температурах ниже 100 °C, которую проводят в водяной бане. Кратность прогрева зависит от температуры: при 70–80 °C — 3 дня, 60–65 °C — 5 дней, 56–58 °C — 6–7 дней. В первый день материалы стерилизуют 2 ч, в последующие дни — 1 ч. в промежутках между прогреваниями стерилизуемый материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор. Коллоидные растворы, сыворотку крови, а также белоксодержащие вещества стерилизуют тиндализацией при 56–58 °C, так как они разрушаются при более высокой температуре.

Автоклавирование. Это стерилизация паром под давлением в сочетании с высокой температурой в специальном аппарате — автоклаве. При встерче насыщенного пара с более холодным объектом пар конденсируется, превращаясь в воду, в результате чего выделяется большое количество тепла. Кроме того, уменьшается объем пара, что способствует его проникновению во внутренние части стерилизуемого материала. Обязательное условие — поступление действительно насыщенного пара, чтобы его соприкосновение с холодным предметом вело к немедленной конденсации и нагреванию. Промышленность выпускает автоклавы вертикальные и горизонтальные.

Вертикальный автоклав — это двустенный металлический котел цилиндрической формы, закрываемый герметично крышкой. Между стенками через специальный кран с воронкой заливают воду до определенного уровня. Внутренняя стенка котла в верхней части снабжена отверстиями, в нижней части котла — краном, через который при нагревании воды пар вытесняет воздух из котла. Сверху на автоклав надевают металлический защитный каркас, причем между ним и самим автоклавом должно быть свободное пространство. Автоклав нагревают включением в электросеть.

Автоклав загружают стерилизуемым материалом, закрывают крышку и кран, через который заливали воду, нижний кран временно оставляют открытым. Нагреваемая вода между стенками автоклава кипит, образующийся пар поднимается вверх и через верхние отверстия внутренней стенки проходит внутрь котла, толчками вытесняя воздух через нижний открытый кран. Когда воздух весь вытеснен и пар начинает выходить ровной струей, нижний кран закрывают. В результате давление пара внутри автоклава повышается. Началом стерилизации считают момент, когда давление достигает заданной величины (судят по показаниям манометра). Нагрев регулируют на протяжении всей стерилизации, поддерживая давление пара на одном уровне. При чрезмерном повышении давления внутри автоклава предусмотрен предохранительный клапан, через который избыток пара автоматический выходит наружу.

При повышении давления пара соответственно повышается и температура в автоклаве:

0,505 × 10⁵ Па (0,5 атм.) — температура 110–112 °C;

1,01 × 10⁵ Па (1 атм.) — 120–121 °C;

1,515 × 10⁵ Па (1,5 атм.) — 124–126 °C;

2,02 × 10⁵ Па (2 атм.) — 132–133 °C.

Манометр показывает давление пара без учета окружающего атмосферного давления (760 мм рт. ст.). по истечении времени стерилизации автоклава отключают. После отсасывании при нулевом показании манометра открывают кран для спуска пара. Крышку открывают осторожно на себя, не заглядывая в котел, оберегая лицо и глаза от возможного остаточного пара. До полного выхода пара открывать крышку нельзя, так как при быстром падения давления внутри автоклава стерилизуемые жидкие среды закипают и выталкивают из пробирок пробки вместе с жидкостью.

Автоклавированием стерилизуют питательные среды, выдерживающие нагревание выше 100 °C (МПА, МПБ), а также физиологический раствор, стеклянную посуду, завернутую в бумагу, перевязочный материал и спецодежду, сложенные в металлические бюксы; обеззараживают использованные бактериальные культуры. При обеззараживание режим работы автоклава 1,5 атм. — 1 ч, при стерилизации чистого материала 0,5 атм. — 30–40 мин Температуре в автоклаве контролируют с помощью контактных термометров, а также химических веществ с различной точкой плавления: бензонафтол (110 °C), бензойная кислота (120 °C) и др. эти вещества помещают в автоклав в пробирках (пастеровских пипетках) с добавлением краски (фуксин, метиленовая синь). Пробирки запаивают и устанавливают в вертикальном положении между стерилизуемым материалом. При определенной температуре вещество-индикатор плавится и приобретает цвет красителя.

Эффективность стерилизации проверяют высевом спорового материала, который предварительно выдерживают в автоклаве вместе со стерилизуемыми объектами. После инкубирования в термостате в течении нескольких дней среды должны остаться стерильными.

Горизонтальный автоклав отличается от вертикального конструкцией, но принцип действия тот же.

Пастеризация. Этот метод предложил Луи Пастер для сохранения питательной ценности пищевых продуктов (молоко, мясные, рыбные и овощные консервы), которая снижается при кипячении (разрушаются витамины и некоторые другие вещества). При пастеризации продукт нагревают до 80 °C 30 мин, затем резко охлаждают (до 4–8 °C). Крупные предприятия (молокозаводы) оснащены специальными пастеризаторами с охладительной системой. Пастеризация снижает количество бактерии: погибают вегетативные формы, а споры сохраняются. Резкое охлаждение и последующее хранение при низкой температуре (4–5 °C) препятствуют прорастанию спор и последующему размножению бактерий.

Стерилизация фильтрованием — метод, с помощью которого обычно стерилизуют жидкости, не выдерживающие нагревания (сыворотки крови, растворы антибиотиков и др.). Жидкости пропускают через бактериологические фильтры. Фильтрование происходит за счет перепада давления, вызванного либо приложением повышенного давления к жидкости, находящейся над фильтром, либо созданием вакуума в приемнике фильтра. Действие фильтра состоит в механической задержке и адсорбции микроорганизмов стенками пор фильтра. Однако следует помнить, что размеры бывают меньше среднего диаметра пор фильтров.

Фильтры выпускают твердые, керамические, цилиндрической формы в виде «свечей», асбестовые — в виде пластинок и мембранные — с наиболее точной калибровкой пор.

Керамические фильтры (Шамберляна, Беркеефльда) производят из смеси каолина и кварцевого песка.

Асбестовые фильтры (Зейтца) — плотные пластины, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой. Отечественные асбестовые фильтры обозначают марками Ф₂ и СФ. К стерилизующим относят фильтры матки СФ.

Мембранные фильтры (коллоидные мембраны, ультрафильтры) представляют собой тончайшие листки из обработанной определенным образом гемицеллюлозы. Фильтры выпускают с порами различного диаметра. Применяют для фильтрации, концентрации веществ, содержащихся в фильтруемом материале, а также для определения размеров вирусов.

Большей частью в работе используют фильтры Зейтца и мембранные фильтры. Фильтры монтируют в специальный держатель-воронку, который вставляют в пробку колбы Бунзена (толстостенная колба с тубусом). Смонтированный фильтр обертывают бумагой и стерилизуют в автоклаве. Фильтруемую жидкость наливают в воронку над фильтром, на тубус колбы надевают резиновую трубку (шланг), присоединенную к ручному или электрическому насосу, выкачиванием воздуха из колбы создают пониженное давление и фильтруют жидкость. Бактерии остаются на фильтре. Стерильность полученных фильтратов проверяют посевом на питательные среды с последующим инкубированием в термостате в течение нескольких дней.

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами — метод, применяемый для обеззараживания воздуха в помещении (боксах, операционных). В лаборатории источником УФ-лучей обычно служат специальные бактерицидные лампы. Бактерицидные лампы также нашли применение в пищевой промышленности при хранении различных продуктов (температура выше 0 °C).

Стерилизация ультразвуком — метод, который используют для обеззараживания воды, молока, некоторых продуктов, а также кожевенного сырья. Стерилизующее действие ультразвука связано с возникновением в цитоплазме бактерий кавитационных пузырьков, заполненных парами под давлением около 10 тыс. атм., вследствие чего разрушаются внутренние структуры бактериальной клетки.

Химические методы стерилизации. Сводятся в лабораторной практике к консервированию питательных сред, вакцин, а также лечебных и диагностических сывороток различными химическими соединениями (соли металлов, щелочи, антибиотики и др.) с целью предупреждения бактериального загрязнения. Питательные среды консервируют хлороформом, толуолом, иногда эфиром (для освобождения от консерванта среду нагревают до 56 °C). Вакцины и лечебные сыворотки консервируют 0,25–0,5%-ным раствором фенола, 0,5%-м раствором хлороформа, 0,5%-м раствором формалина или раствором мертиолата (в конечном разведении 1:5000–1:10 000). Для консервирования агглютинирующих сывороток используют борную кислоту, толуол, глицерин.

Биологические методы стерилизации. Применяются в вирусологии для стерилизации живых культур клеток. Стерилизацию проводят с помощью антибиотиков: пенициллин, стрептомицин, нистатин и т. д.

Подготовка посуды для стерилизации

Лабораторная посуда должна быть чисто вымытой и простерилизованной. Для мытью используют растворы мыла или химические моющие средства. Новую посуду предварительно кипятят в 1–2%-м растворе соляной кислоты, чтобы избежать последующеговыщелачивания стекла. Вымытую в проточной воде посуду ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Бактериологические пробирки, конические, матровые колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, состоящими из плотно скрученных валиков ваты, покрытых слоем марли. Для бактериологических пробирок также разработаны металлические пробки в виде наружных колпачков. Следует учитывать, что стерилизация ватных пробок при высокой температуре приводит к выделению из ваты веществ, ингибирующих рост некоторых чувствительных бактерий, например бруцелл.

При монтаже мерных пипеток, пипеток Пастера в верхний конец вставляют ватный тампон. У пипеток Пастера должен быть запаян капилляр. Каждую мерную пипетку заворачивают длинной полоской бумаги шириной 4–5 см, начиная с носика, винтообразно, по всей длине. Пипетки Пастера заворачивают в бумагу по 10–20 штук, пробирки — по 15–20 штук. Все виды пипеток лучше хранить до, и после стерилизации в специальных металлических пеналах. Пробки на колбах дополнительно покрывают колпачками из бумаги.

Чистые чашки Петри в собранном виде перед стерилизацией заворачивают в бумагу по 3–4 штуки. После стерилизации бумага предохраняет стерильную посуду от загрязнения микрофлорой.

Посуду в стерильном шкафу перед стерилизацией размещают не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха, и следят, чтобы температура не превышала 180 °C, так как при более высокой температуре бумага и вата будут обугливаться. После окончания стерилизации сушильный шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не снизится до 70–80 °C, поскольку резкий температурный перепад может привести к разрушению стекла.

Если посуда предназначена для стерилизации в ней питательных сред автоклавированием под давлением не менее 1 атм., то ее предварительно не стерилизуют. При стерилизации сред текучим паром или в автоклаве под давлением не более 0,5 атм. необходимо

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с работой автоклава и аппарата Коха. Определить достоинства и недостатки каждого метода стерилизации.

Задание 2. Смонтировать фильтр Зейтца и простерилизовать жидкость (сыворотку крови) фильтрованием.

Задание 3. Подготовить стеклянную посуду (чашки Петри, колбы и т. д.) и питательные среды для стерилизации.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Что такое стерилизация, какие требования к ней предъявляют?

2. Каковы основные методы стерилизации, какие методы применяют в своей практической работе врачи?

3. Каковы устройство и назначение автоклава? Как контролируют качество его работы?

4. На чем основан метод стерилизации текучим паром? Чем обусловлено его применение?

5. Чем обусловлено применение методов дробной стерилизации?

6. Каковы устройство и назначение сушильного шкафа? Какие материалы и при каких температурных режимах стерилизуют сухим жаром?

7. Что представляют собой мембранные фильтры?

8. Как осущестляется контроль температуры в автоклаве?

9. Сущность пастеризации и его применение.

10. Как осуществляется подготовка посуды к стерилизации?

11. Особенности стерилизации мерных пипеток.

Глава 1.7. Методы выделения чистой бактериальной культуры микроорганизмов (в аэробных и анаэробных условиях)

1.7.1. Цель занятия

Освоить методы выделения чистых бактериальных культур аэробных и анаэробных микроорганизмов.

1.7.2. Материалы и оборудование

Бульонные и агаровые культуры B. cereus, E. coli и S. aureus в пробирках и чашках Петри.

1.7.3. Теоретический материал

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) клеток выросших на питательной среде.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Смешанная бактериальная культура содержит два или несколько известных видов микробов.

Загрязненная бактериальная культура содержит помимо известных и неизвестные виды микробов.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

Методы получения чистой бактериальной культуры аэробов

Механические методы:

а) метод Дригальского (метод пластинчатого посева). Этот метод наиболее легко выполнимый. Исследуемый материал бактериологической петлей наносят на поверхность МПА и шпателем растирают на поверхность среды. Этим же шпателем, не обжигая его, растирают (засевают) на поверхности среды второй чашки и т. д. (до 10 ч. Петри с МПА). Культивируют в термостате. Рост изолированных колоний обычно достигается в последних чашках. Выбирают наиболее чаще встречаемую (по культуральным свойствам) изолированную колонию и пересевают ее на МПА и МПБ. Так получают чистую бактериальную культуру.

б) метод Пастера (метод разведений). Исследуемый материал последовательно разводят в жидкой питательной среде. С этой целью берут ряд пробирок (до 10) со стерильным МПБ. Пипеткой исследуемый материал вносят в первую пробирку, перемешивают, из нее небольшое количество (0,1 мл) переносят во вторую, после перемешивают и переносят в третью и т. д. Затем берут 10 чашек Петри со стерильным МПА и содержимое пробирок переносят в чашки Петри. Шпателем каплю растирают равномерно по поверхности среды (каждый раз шпатель фламбируют). Чашки Петри ставят в термостат для культивирования (температура равна 37 °C, на 24 часа). Из последних чашек Петри выбирают наиболее чаще встречаемые изолированные колонии и пересевают из одной колонии при помощи пастеровской пипетки на свежие питательные среды (МПА, МПБ). Повторно культивируют и получают чистую бактериальную культуру.

Существуют и другие механические методы выделения чистой бактериальной культуры. При отсутствии навыков у экспериментатора изолированные колонии легче получить следующим образом.

Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющее дно на 3 сектора (А). Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности агара в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крышку чашки сначала приподнимают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламени и дают ей остыть (15 сек.) (Б). Проводят петлей по поверхности среды в секторе 2, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на поверхности среды в секторе 3 (Г). Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как показано на рисунке для того, чтобы конденсирующая вода с крышки не попала на поверхность агара (Д). В секторе 1 вырастет большое число колоний, тогда как в секторах 2 и 3 появляются отдельные хорошо изолированные колонии.

Физический метод. Этот метод применяется для выделения чистой бактериальной культуры спорообразующих видов бактерий. Исследуемый материал выдерживают в водяной бане при t° 80 °C 30–40 мин Вегетативные формы микроорганизмов погибают, споры сохраняются жизнеспособными. Далее выбирают любой из вышеописанных методов.

Химический метод. Этот метод основан на бактерицидном или бактериостатическом действии химических веществ на микроорганизмы. Чаще всего этот метод применяют для выделения чистой культуры возбудителя туберкулеза. Исследуемый материал (кусочки пораженных органов вместе с туберкулами) помещают в 10%-й раствор серной кислоты на 10–20 минут. Все остальные микроорганизмы погибают, а возбудитель туберкулеза является кислотоустойчивым. При посеве такого материала на специальные питательные среды получают чистую культуру микобактерий туберкулеза.

Биологический метод или биопроба. Биопроба — это заражение лабораторных животных. Исследуемый материал вводят восприимчивому животному (белая мышь, морская свинка, кролик, голубь).

В организме у лабораторного животного развивается, размножается и вызывает заболевание тот микроб который был патогенным. Лабораторное животное вскрывают, делают посевы из внутренних органов и выделяют чистую культуру.

Методы выделения чистой бактериальной культуры анаэробов

Для выделения чистой бактериальной культуры анаэробных видов создают условия анаэробиоза. Это осуществляется следующими методами:

а) физический — путем удаления воздуха насосом из эксикатора или анаэростата, где помещены питательные среды с посевами анаэробов. После удаления воздуха их культивируют в термостате;

б) химический — используют окислители, поглощающие кислород. Например, по способу Аристовского анаэробные условия создаются путем поглощения кислорода гидросульфитом натрия (Na₂S₂O₄) или пирогаллолом при смешивании их с карбонатом натрия, на поверхность которого насыпают тонким слоем порошок гидросульфита (1,5 г) или пирогаллола (7,5 г). Перемешивают порошок и слегка увлажняют водой при помощи пульверизатора. Одну половину чашки закладывают на дно специального ведерка, на нее помещают чашки Петри с посевами — один на другую, вверх дном. Поверх чашек под крышку ведерка закладывают вторую половинку чашки с поглощающей смесью. Все пространство ведерка заполняют чашками с посевами или подходящим по размеру кружками из дерева или резины. После заполнения ведерко опускают в аппарат, который закрывают крышкой, завинчивают винт и закрепляют крышку. Аппарат ставят в термостат. Карбонат натрия можно употреблять повторно до 30 раз, гипосульфит следует менять при каждом употреблении аппарата;

в) биологический — применение аэробных микробов, энергично поглощающих кислород воздуха с анаэробами. Существует несколько вариантов биологических методов.

Наиболее часто применяют метод Фортнера: питательный агар наливают в чашку Петри и ее крышку. Можно разрезать агар, налитый в чашку Петри по диагонали узкой щелью. На одну из половинок или на поверхность агара в крышке засевают культуру аэробного микроорганизма, жадно поглощающего кислород (кишечную палочку, чудесную палочку), а на другую половину чашки или на поверхность агара в чашке высевают исследуемый материал. Чашку закрывают и замазывает парафином или пластилином. Аэробные бактерии быстро используют кислород в герметически закрытой чашке, а потом начинают размножаться анаэробы. Через 24–48 час. Чашку открывают и выделяют колонии для получения чистой культуры.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Провести выделение чистых культур микроорганизмов методом Дригальского.

Задание 2. Выделить чистую микробную культуру анаэробных видов.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

2. Что такое колония микробов?

3. Какая бактериальная культура называется чистой, смешанной, загрязненной?

4. Какие существуют механические методы выделения чистой бактериальной культуры?

5. Какова особенность физического метода выделения чистой бактериальной культуры?

6. В чем сущность химического метода выделения чистой бактериальной культуры?

7. Что такое биопроба?

8. В чем особенность выделения чистой бактериальной культуры спорообразующих микроорганизмов?

9. Методы посевов штрихом в чашке для получения изолированных колоний?

10. Какие существуют физические и химические методы создания условий анаэробиоза?

11. Как осуществляется биологический метод выделения чистой бактериальной культуры анаэробных форм бактерий?

Глава 1.8. Биохимические свойства микроорганизмов

1.8.1. Цель занятия

Изучить биохимическую дифференциацию микроорганизмов. Установить различие между эшерихиями и сальмонеллами на средах с углеводами и многоатомными спиртами (цветной ряд, среда Эндо). Провести химическое и микроскопическое исследования культуры и изучить основных представителей процесса аммонификации.

1.8.2. Материалы и оборудование

Культуры аммонифицирующих микроорганизмов на МПБ и МПА (Bac. mycoides, Bac. mesentericus, Bac. subtilis, фуксин Пфейффера, предметные и покровные стекла, микроскопы, горелки, спички, посевы культур E. colli, S. dublin на МПБ и МПА, а также на средах с углеводами и многоатомными спиртами (лактоза, сахароза, глюкоза, маннит, дульцит и др.), посев этих культур на среде Эндо в чашках Петри, кедровое масло. Таблицы: биохимическая дифференциация энтеробактерий — микробов кишечно-сальмонеллезной группы, аммонифицирующие микроорганизмы.

1.8.3. Теоретический материал

Жизненные процессы микроорганизмов тесно связаны с деятельностью ферментов. Каждому виду микробов свойственны определенные ферменты, что позволяет дифференцировать их с учетом других признаков и свойств.

Сахаралитические свойства микробов

Ферменты, образуемые микробами, обладают способностью расщеплять сахар (углеводы и многоатомные спирты) на альдегиды и кислоты. Конечные продукты ферментации — диоксид углерода (СО₂) и водород. Разные ферменты неодинаково реагируют с одними и теми же сахарами. Это их свойство используется при биохимической дифференциации микроорганизмов.

Сахаралитические свойства микробов выявляют на средах с сахарами (средах Гисса), которые представляют собой смесь сахара и индикатора в пептонной воде. Из сахаров используют лактозу, сахарозу, глюкозу, мальтозу, арабинозу, маннит, дульцит и др. В качестве индикаторов применяют нейтральный красный лакмус, фуксин основной и т. д. Среды могут быть жидкими, тогда для улавливания газа на дно пробирки опускают «газовки» — маленькие пробирки, перевернутые (направленные) закрытым концом вверх. Образовавшийся в процессе ферментации газ вытесняет часть среды и скапливается в верхней части «газовки».

В полужидких средах с углеводами и индикатором ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты) могут наблюдаться разрыв столбика агара и скопление мелких пузырьков в толще среды и на ее поверхности, а также изменение цвета. При нейтральной реакции индикатор не изменяется (бесцветный), в кислой среде он принимает синий цвет, в щелочной — красный. В такой же цвет окрашивается и агар. Чистые культуры высевают на такие среды и выдерживают в термостате при определенной температуре (для патогенных –37, для сапрофитов — 25–30 °C).

К биохимической дифференциации прибегают обычно в том случае, если микроорганизмы имеют много общих признаков: трудно различимый рост на питательных средах, клетки, морфологически похожие друг на друга, и т. д. Такое сходство наблюдается среди эшерихий и сальмонелл.

При их дифференциации кроме сбраживания сахаров учитывают способность свертывать молоко, образовывать газы и другие свойства.

В молоке содержится лактоза, которую сбраживает кишечная палочка. В результате образуется кислота, обуславливающая свертывание продукта. При высеве на молоко возбудителя сальмонеллеза кислота не продуцируется.

Биохимическую дифференциацию осуществляют и на среде Эндо. Среду (в сухом виде) готовят по следующей прописи: 5 г порошка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, нагревают при помешивании до кипения и через 2–3 мин Разливают в чашки. Можно также расплавить мясопептонный агар, добавляя к нему 1% растворенную и прокипяченную в дистиллированной воде лактозу и индикатор (1 мл спиртового раствора фуксина, обесцвеченного 10% свежим раствором сульфита натрия). При обесцвечивании основного фуксина раствором сульфита натрия образуется бесцветная фуксино-сернистая кислота. Среду смешивают, разливают по чашкам и предохраняют от действия света. При сбраживании микробами лактозы образуется кислота, восстанавливается фуксин, который окрашивает колонии в красный цвет. Кишечная палочка (эшерихий) на среде Эндо продуцирует красные колонии с металлическим оттенком. Цвет колоний сальмонеллезных бактерий не изменяется, так как они не сбраживают лактозу.

Протеолитические свойства микробов

Определение аммиака. Аммиак (продукта гнилостного распада белков) выявляют по изменению красной лакмусовой бумаги, которая в присутствии этого вещества синеет. Аммиак в среде можно также установить при помощи реактива Несслера. Для этого в фарфоровую чашку пипеткой вносят каплю культуры аммонификаторов, выращенной на мясопептонном бульоне, и такое же количество реактива Несслера. При наличии аммиака смесь окрашивается в желтый или коричневый цвет (в зависимости от количества). Коричневое окрашивание указывает на большое содержание продукта гнилостного распада.

Определение сероводорода. Сероводород (конечный продукт серосодержащих аминокислот — цистина, цистеина, метионина) можно обнаружить с помощью полоски фильтровальной бумаги размером 10 мм × 15 см, обработанной раствором уксуснокислого свинца и подвешенной над культурой исследуемых микробов. При содержании сероводорода бумага чернеет, который превращает уксуснокислый свинец в сернокислый. Сероводород на белковых средах образует аммонификаторы и другие организмы.

Определение индола. Индол (продукта превращения аминокислоты триптофана) выявляют на среде без углеводов, особенно глюкозы, которая препятствует его образованию. Индолообразование — один из признаков при определении вида микробов, поэтому его используют при их дифференциации. Существует несколько методов определения индола (Эрлиха, Сальковского, Строгова и др.), но наиболее простой и доступный из них — метод Морелли. Определение по этому методу проводят с помощью полоски фильтровальной бумаги, смоченной горячим насыщенным (12%) водным раствором щавелевой кислоты и высушенной в термостате. Бумагу подвешивают так же, как и при определении продуктов аммонификации. Культуру выращивают трое суток в термостате, затем определяют результаты взаимодействия продуктов жизнедеятельности микробов и щавелевой кислоты. Порозовение нижней части индикаторной бумаги указывает на наличие индола.

Определение каталазы. Фермент каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Для ее определения на предметное стекло наносят каплю 2–3% раствора пероксида водорода и такое же количество микробной культуры. При наличии у данного вида микробов каталазы выделяются пузырьки газа (кислород).

Гемолитические свойства микробов

Некоторые виды бактерий в процессе жизнедеятельности вырабатывают особые вещества, обладающие лизирующим (растворяющим) действием на эритроциты. Эти вещества белковой природы называются гемотоксинами. Для определения гемолитической способности производят посев на питательные среды, содержащие 5% дефибринированной крови (чаще используют кровяной МПА). При росте на кровяной среде микроорганизмов, обладающих гемолитическими свойствами, вокруг колоний в результате лизиса эритроцитов образуется прозрачная зона (бесцветная или окрашенная). В жидких питательных средах при гемолизе среда становится прозрачной (красно-лаковая кровь).

Редуцирующие свойства микробов

Их выявляют на искусственных и естественных средах (МПБ, МПА, молоке и др.), содержащих индикаторы (органические красители). Микробы, образующие ферменты оксидазы и дегидразы, окисляют одни органические вещества и восстанавливают (редуцируют) другие. Одновременно с восстановлением происходит их обесцвечивание, в результате чего среда принимает прежнюю окраску.

Молоко с метиленовым голубым. К 100 мл хорошо обезжиренного и профильтрованного молока (рН 7,2) добавляют 2 мл 1% водного раствора метиленового голубого, после чего молоко приобретает интенсивно-голубой цвет. Среду стерилизуют текучим паром дробно. При редукции метиленового голубого молоко обесцвечивается и приобретает кремовый или белый цвет. Редуцирующие свойства микробов можно также определять на лакмусовом молоке, среде Омелянского, Ротбергера и др.

Редукция нитратов (денитрификация) — это способность микробов восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты), а затем в аммиак и свободный азот. Редукцию нитратов определяют посевом на специальную среду: к МПБ добавляют 2% азотнокислый калий (калийную селитру), свободного от нитритов, затем засеивают культуру исследуемых микробов и через 48–72 часа культивирования в термостате при 37–38 °C добавляют 1 мл реактива, содержащего йодистый калий, и 10% Н₂О₄ в определенных пропорциях. При редукции нитратов в нитриты появляется темно-синие окрашивание среды.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с тестами, характеризующими ферментативные свойства бактерий (ферментация углеводов в средах Гисса, образование индола, сероводорода; тесты на каталазу).

Задание 2. Используя карточки с описанием свойств бактериальной культуры, при помощи определителя микробов установить ее видовую принадлежность.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Методы определения сахаролитических свойств микроорганизмов.

2. Методы определения протеолитических свойств микроорганизмов (индола, сероводорода, аммиака).

3. Определение гемолитических свойств микроорганизмов.

4. Как определяют редуцирующие свойства микробов?

Глава 1.9. Антибиотики. Методы определения антибиотикорезистентности бактерий

1.9.1. Цель занятия

Ознакомить студентов с методами определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

1.9.2. Материалы и оборудование

Стерильные чашки Петри с МПА, пробирки с чистой культурой стафилококка и кишечной палочки, стерильные градуированные «концевые» пипетки на 2 мл, резиновые груши, набор стандартных дисков с разными антибиотиками, стерильные пинцеты, линейки.

1.9.3. Теоретический материал

Антибиотики

Это вещества, образуемые бактериями, грибами, растениями, животными тканями, способные убивать микроорганизмы или подавлять их рост. Абсолютное большинство известных антибиотиков получают из актиномицетов. Бактерии синтезируют такие антибиотики, как полимиксины, грамицидины, бацитрацин, гризин. Из грибов выделены пенициллины, цефалоспорины, фумагиллин, гризеофульвин, из животных тканей — эритрин, экмолин, из высших растений — аллицин и др. Часть антибиотиков получают химическим синтезом (левомицетин), а большинство — биосинтезом.

Активность препаратов определяют бактериологическими или физико-химическими методами. Биологическую активность антибиотиков выражают в условных единицах действия — ЕД. За 1 ЕД принимают специфическую активность, содержащуюся в 1 мкг чистого препарата, но для бензилпенициллина 1 ЕД равна 0,5988 мкг химически чистой натриевой соли препарата. Активность товарных антибиотиков чаще всего выражают в мкг активного вещества, содержащегося в 1 мг препарата.

Успех лечения инфекционных заболевании человека и животных зависит от выбора эффективного лекарственного средства с учетом чувствительности к нему возбудителя болезни. Материал для лабораторного исследования следует брать до лечения антимикробными препаратами. Чувствительность микроорганизма к антибиотикам определяют с чистой культурой возбудителя.

Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков). Это наиболее простой в исполнении метод. В качестве питательной среды применяют МПА, агар на переваре Хоттингера с содержанием 120–140 мг% аминного азота (рН 7,2–7,4) или агар фирмы «Дифко». Диски с антибиотиками (диаметр 5–6 мм) готовят из специальных сортов фильтровальной бумаги. Каждый диск содержит определенное количество антибиотика, которое указано на этикетке флакона. Во флаконе насыпают силикагель, который впитывает влагу и служит индикатором: при переувлажнении меняет окраску с синей на розовую. При изменении окраски силикагеля во флаконе диски для использования не пригодны. Флаконы с дисками хранят при температуре 4–20 °C.

Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри по 20 мл (толщина слоя 4–5 мм). Перед посевом чашки со средой досушивают в термостате. Для посева используют суточную бульонную культуру или смывы суточной агаровой культуры. 1 мл микробной суспензии в физиологическом растворе (концентрация клеток 10⁹/мл) наносят на агар и покачиванием чашки распределяют по поверхности питательной среды. Избыток жидкости удаляют стерильной пастеровской пипеткой. Засеянные чашки Петри подсушивают при комнатной температуре 30–40 мин, а затем на поверхность среды стерильным пинцетом накладывают, плотно прижимая, диски с разными антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашки. Чашки с дисками выдерживают в термостате при 37 °C 18 ч в положении вверх дном.

Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий, формируя таким образом вокруг диска зону отсутствия роста. Ближе к диску концентрация антибиотика в агаре выше, по мере удаления от диска концентрация снижается. Следовательно, чем ближе диаметр зоны задержки роста вокруг антибиотика, тем более чувствительна к нему исследуемая культура.

Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста микроорганизмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точностью 1 мм. Отсутствия зоны задержки роста микроорганизмов вокруг диска указывает на устойчивость исследуемой культуры к данному антибиотику. При зоне задержки роста до 14 мм говорят о малой чувствительности к антибиотику, от 15 до 25 мм — о достаточной чувствительности, свыше 25 мм — о высокой чувствительности.

Чтобы получить более точные результаты исследования, необходимо соблюдать стандартные условия при постановке опыта. Для проверки точности и стандартности определения чувствительности к антибиотикам Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендует контролировать диски на эталонных штаммах микроорганизмов, которыми служат три культуры из Американской коллекции типовых культур или из Национальной коллекции типовых культур в Англии: S. aureus (АТСС 25923, № СТС 6571), E. coli (АТСС 25922, № СТС 10418), P. aeruginosa (АТСС 27853, № СТС 10662).

Метод серийных разведений. Для проведения опыта готовят основные растворы антибиотиков, используя стандарты антибиотиков. На этикетке ампулы со стандартом указана концентрация антибиотика в ЕД/мл или мкг/мл. навески бензилпенициллина калиевой или натриевой соли, ампициллина тригидрата, оксациллина натриевой соли, цефалотина, цефалексина растворяют в 1/15 М фосфатном буфере. Основные растворы тетрациклиновых антибиотиков готовят на 0,01н. растворе соляной кислоты. Для приготовления основных растворов нео-, моно-, канамицина используют дистиллированную воду. Концентрация основных растворов антибиотиков 1000 мкг/мл.

Метод серийных разведений на жидкой питательной среде: при поределении чувствительности к антибиотикам для основной массы микроорганизмов используют МПБ или бульон на переваре Хоттингера, для стрептакокков в среду добавляют 1% глюкозы, для патогенных грибов используют среду Сабуро.

Агаровые или бульонные культуры микроорганизмов предварительно разводят физиологическим раствором до концентрации клеток 5×10⁶/мл.

Схема опыта приведена в табл. 1.9.3.1.

Учет результатов: наименьшее количество антибиотика, дающее визуально полную задержку роста (бульон прозрачный), соответствует минимальной подавляющей концентрации препарата (МПК).

Минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) определяют высевом на плотные питательные среды из последних прозрачных пробирок, которые предварительно встряхивают.

Наименьшее количество антибиотика в пробирке, содержимое которой после инкубирования в течение 24–72 ч не дало роста бактерий при высеве на питательную среду, принимают за МБцК.

Таблица 1.9.3.1

Определение чувствительности микроорганизма к антибиотику (в жидкой питательной среде)

Компонент
Количество компонента (мл) в пробирке

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Питательная среда
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5
4,5

Основной раствор антибиотика
4,5
Последовательный перенос по 4,5 мл*, начиная с 1-й пробирки
–

Культура микроорганизма
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

Перемешивают встряхиванием.
Инкубируют в термостате при 37 °C 18–20 ч.

* Из 14-й пробирки убрать 4,5 мл. Первая пробирка содержит 500 мкг/мл антибиотика, каждая последующая — в два раза меньше.

Метод серийных разведений на плотной питательной среде: для определения чувствительности к антибиотикам большинства микроорганизмов используют МПА или агар на переваре Хоттингера с содержанием аминного азота 120–140 мг/мл, рН 7,2–7,4. Приготовленный основной раствор антибиотиков разводят в плотной питательной среде. Для этого к расплавленному и охлажденному до 55 °C агару, разлитому в широкие пробирки по 18 мл, добавляют по 2 мл соответствующего разведения определенного разведения определенного антибиотика, тщательно перемешивают и переливают в стерильную чашку Петри. После застывания агара чашки Петри подсушивают в течении 1 ч. Контрольные чашки Петри с агаром не содержат антибиотика. Все чашки Петри делят на сектора, каждый из которых засевают исследуемой культурой. Посев делают бактериологической петлей из микробной суспензии с концентрацией клеток 10⁶–10⁷/мл чашки помещают в термостат при 37 °C на 20–24 ч.

Наименьшую концентрацию антибиотика, при которой наблюдают полную задержку роста бактерий на агаре или рост единичных колоний, принимают за МПК препарата. В том случае, когда рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме контрольной, считают, что исследуемые концентрации антибиотиков превышают МПК препарата. Если на всех чашках отмечают рост культуры, это значит, что микроорганизм устойчив ко всем концентрациям антибиотика.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Определить чувствительность культуры стафилококка к антибиотикам методом бумажных дисков.

Задание 2. Определить чувствительность культуры кишечной палочки к антибиотикам методом серийных разведений на жидкой питательной среде.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Что такое антибиотики?

2. Как используют антибиотики в ветеринарии, в животноводстве?

3. Перечислите кормовые антибиотики.

4. Как осуществляется определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар?

5. Какова особенность определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений на жидкой питательной среде?

6. Как осуществляется определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений на плотной питательной среде?

7. Что принимают за минимальную подавляющую концентрацию антибиотика?

8. Как определяется бактериостатическая и бактерицидная доза антибиотика?

Раздел 2. ИММУНОЛОГИЯ. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 2.1. Серологические реакции. Техника постановки и учет результатов реакции агглютинации, преципитации (РА, РП)

2.1.1. Цель занятия

Ознакомиться с реакциями агглютинации и гемагглютинации, с техникой их постановки и учета результатов.

Ознакомиться с сущностью и техникой постановки реакций кольцепреципитации, диффузионной преципитации. Рассмотреть их практическое использование.

2.1.2. Материалы и оборудование

Культуры E. сoli различной серогрупповой принадлежности на МПА, О-агглютинирующие диагностические эшерихиозные сыворотки, бруцеллезный роз-бенгал антиген, положительная бруцеллезная сыворотка, планшеты с результатами титрования иммунной сыворотки в РНГА, единый бруцеллезный антиген, мерные пипетки, автоматические пипетки, аппарат Флоринского, микротитратор «Такачи».

Сибиреязвенная прицепитирующая сыворотка, стандартный сибиреязвенный антиген, стерильный физиологический раствор, пипетки Пастера, пробирки Уленгута, 1,5%-й агаровый гель с мертиолатом (конечное разведение 1:10 000), стерильные чашки Петри, штампы для РДП. Автоматические пипетки, аппарат Флоринского, микротитратор «Такачи».

2.1.3. Теоретический материал

Взаимодействие антигена и антител происходит строго специфично и направлено в организме на нейтрализацию возбудителя и его токсинов. Взаимодействие антигена и антител in vitro при определенных условиях сопровождают видимые феномены (агглютинация, преципитация, иммунный лизис), что позволяет использовать АГ — АТ-реакции, получившие название серологических (лат. serum — сыворотка), в практических целях. Биофабрики выпускают антигены и иммунные сыворотки (антитела) известной специфической направленности (диагностические). При помощи таких сывороток в серологических реакциях можно идентифицировать неизвестный микроорганизм или, применяя известный антиген, обнаружить в организме антитела, синтезированные в ответ на внедрение возбудителя, и таким образом поставить диагноз (серологическая диагностика). Кроме того, серологические реакции можно использовать для оценки интенсивности иммунного ответа после вакцинации или перенесенной инфекционной болезни.

Антигенные детерминанты корпускулярных антигенов специфически взаимодействуют с гомологичными антителами (специфическая, невидимая фаза реакции), а затем комплексы — антиген антитело образуют крупные, видимые невооруженным глазом конгломераты, которые выпадают в осадок — агглютинат (неспецифическая, видимая фаза реакции). Антигены и антитела взаимодействуют лишь в растворе электролита (в 0,8%-м растворе хлорида натрия).

Реакция агглютинации (РА) — в результате специфического взаимодействия между антигеном и антителами происходит склеивание антигенов между собой и выпадение их в осадок. Характер осадка зависит от природы антигена. Жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевидный осадок (склеивание жгутиками), безжгутиковые и бескапсульные — мелкозернистый (сомо — склеивание телами), капсульные — тяжистый. Различают агглютинацию прямую, при которой во взаимодействии со специфическими антителами непосредственно участвуют собственные антигены бактериальной или любой другой клетки, например эритроцитов; и непрямую, или пассивную, при которой бактериальные клетки, или эритроциты, или частицы латекса являются носителями не собственных а сорбированных на них чужих антигенов (или антител) для выявления специфических к ним антител (или антигенов). Разработано несколько вариантов реакции агглютинации.

РА на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят раздельно каплю известной агглютинирующей диагностической сыворотки и каплю физиологического раствора (контроль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раздельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2–4 мин

Учет результатов: в контрольной пробе изменения должны отсутствовать. При специфическом соответствии культуры бактерий иммунной сыворотки появляются хлопья агглютината (положительный результат), в случае отсутствия феномена агглютинации делают заключение о том, что исследуемая культура бактерий не соответствует иммунной сыворотке.

Роз-бенгал проба применяется для серологической диагностики бруцеллеза. На предметное стекло или пластинку наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезного антигена (окрашенные розовым бенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно перемешивают покачиванием стекла и через 4 мин учитывают результат.

Учет результатов: при положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината.

Вышеописанные серологические реакции относят к качественной, так как с их помощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание.

Пробирочная РА. Рассмотрим на примере диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. Схема постановки опыта приведена в табл. 2.1.3.1. Общий объем компонентов реакций 1 мл.

Таблица 2.1.3.1

Схема постановки пробирочной РА для обнаружения антител в сыворотке крови

Компонент реакции
Количество компонента (мл) в пробирке

1-й (исходное разведение и контроль антигена)
2-й
3-й
4-й
5-й
6-й (кон-
троль анти-
гена)

Физиологи-
ческий раствор
2,4
–
0,5
0,5
0,5
0,5

Исследуемая сыворотка крови
0,1
0,5 из 1-й проб.
0,5 из 1-й проб.
Последовательный перенос по 0,5 мл, начиная
с 3-й проб.
–

Полученное разведение
1:25
1:25
1:50
1:100
1:200

Бруцелле-
зный антиген,
10⁹ кл/мл
–
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

Конечное разведение
1:25
1:50
1:100
1:200
1:400

Перемешивают встряхиванием и инкубируют при 37–38 °C 18–20 час.
* Из 5-й пробирки удаляют 0,5 мл жидкости перед добавлением антигена.

Одновременно по аналогичной схеме исследуют заведомо положительную и отрицательную сыворотки (положительный и отрицательный контроли).

Учет результатов начинают с контрольных пробирок — не должно быть спонтанной (неспецифической) агглютинации в 6-й пробирке (контроль антигена) и хлопьев осадка в 1-й пробирке (контроль сыворотки). В остальных пробирках наличие и интенсивность агглютинации учитывают визуально и оценивают в крестах:

1) (++++) — полная агглютинация — хорошо выраженный осадок и полное просветление жидкости (агглютинировало 100% антигена);

2) (+++) — неполная агглютинация с хорошо выраженным осадком и со слабой опалесценцией жидкости (агглютинировало 75% антигена);

3) (++) — частичная агглютинация с небольшим осадком, надосадочная жидкость мутная (агглютинировало 50% антигена);

4) (+) — очень небольшой осадок, жидкость непрозрачная (агглютинировало 25% антигена);

5) (–) — отсутствие агглютинации, осадка нет, жидкость мутная.

За положительный результат принимают агглютинацию минимум на два креста. Максимальное разделение исследуемой сыворотки крови, обеспечивающее агглютинацию минимум на два креста или более, называют титром сыворотки. Титр сыворотки отражает количественное содержание антител в крови исследуемого животного.

Из приведенного примера (табл. 2.1.3.2) видно, что антиген специфичен, так как отсутствует спонтанная агглютинация с физиологическим раствором и нормальной (отрицательной) сывороткой, и активен — взаимодействует с заведомо положительной сывороткой. Следовательно, можно учитывать результаты РА с исследуемой сывороткой крови. Титр исследуемой сыворотки (титр антител) в данном случае составляет 1:200.

Таблица 2.1.3.2

Учет результатов РА для обнаружения антител в сыворотке крови

Сыворотка крови
Номера пробирок
(разведение сыворотки)

1 (конт-
роль сыво-
ротки)
2 (1:50)
3 (1:100)
4 (1:200)
5 (1:400)
6 (конт-
роль анти-
гена)

Исследуемая
–
++++
++++
+++
+
–

Положите-
льная (контроль)
–
++++
++++
++++
+++
–

Отрицате-
льная (контроль)
–
–
–
–
–
–

Пробирочную РА используют для серологической диагностики инфекционных болезней, для оценки активности диагностических агглютинирующих сывороток и интенсивности иммунного ответа на фоне вакцинации.

Количество антител может служить диагностическим критерием. Под диагностическим титром понимают минимальное количество антител к данному антигену в исследуемой сыворотке, заведомо превышающее количество нормальных антител к используемому в реакции антигену в сыворотке животного того же вида. При диагностическом титре антител и выше животное рассматривают как больное или переболевшее. При некоторых инфекциях этот подход не всегда продуктивен, и тогда исследуют «парные сыворотки», т. е. сыворотки, взятые от животного дважды с интервалом три-четыре недели, причем первую пробу необходимо брать не позднее двух-трех суток после появления клинических симптомов болезни. На активный инфекционный процесс указывает существенное повышение титра антител во второй пробе.

Для идентификации микроорганизмов используют пробирочную РА, если из-за антигенного родства с различными видами или внутривидовыми сероварами в РА на стекле микроорганизм идентифицировать не удалось.

Например, если культура E. coli дает в РА на стекле положительный результат одновременно с иммунными сыворотками против нескольких О-серогрупп, ее испытывают как антиген с теми же сыворотками уже в пробирочной РА и относят к той О-серогруппе, с сывороткой которой она дает максимальные титры.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Реакцию ставят на плексиглазовых пластинках с луночками. Реакция относится к серологической реакции осадочного типа. В ней используют растворимые микробные антигены, сорбированные на эритроцитах как носителях (антигенный диагностикум), или сорбированные на эритроцитах антитела известной иммунной сыворотки (антительный диагностикум). Антигенные диагностикумы применяют для серологической диагностики, антительные — для обнаружения антигенов в исследуемом материале.

Обнаружение антител в сыворотке крови. Сыворотку крови перед исследованием инактивируют в водяной бане при 56 °C 30 мин и проверяют на наличие антител к антигенам собственно эритроцитов. Для удаления антиэритроцитарных антител исследуемую сыворотку крови предварительно адсорбируют несенсибилизированными эритроцитами.

РНГА на стекле применяют для диагностики пуллороза — тифа птиц (качественная кровекапельная реакция непрямой гемагглютинации — ККРНГА). На сухое обезжиренное стекло глазной пипеткой наносят антиген и свежую кровь (в соотношении 1:1), взятую из гребня или подкрыльцовой вены птиц, и смешивают, покачивая стекло. Реакцию считают положительной при выпадении в течение двух минут в смеси крови с антигеном хлопьев коричневого цвета.

Параллельно ставят контроли с позитивной и негативной сыворотками.

Реакция коагглютинации. Является одним из вариантов пассивной, т. е. опосредованной клетками носителями антител ускоренной РА на стекле. В основу этой реакции положено уникальное свойство золотистого стафилококка, имеющего в составе своей клеточной стенки белок А, связываться с Fc-фрагментами IgG и Ig M. При этом активные центры антител остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигенов. На предметное стекло наносят каплю 2%-ной взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, и добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий. При соответствии антигена и антител через 30–60 с происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков.

Иммуномагнитное обнаружение антигенов. Один из вариантов ускоренной реакции агглютинации на стекле. Связан с применением супермагнитных полимерных частиц, покрытых специфическими антителами. Одна такая частица связывает до 10⁷–10⁸ клеток микроорганизмов, благодаря чему чувствительность данного метода достигает 5 КОЕ/мл. Иммуномагнитное обнаружение микроорганизмов можно применять в комплексе с ПЦР.

Реакция преципитации (РП) и ее модификации

Теоретический материал. В реакции преципитации (РП в отличии от РА используют не корпускулярные, а растворимые антигены микроорганизмов. Образование комплексов антиген — антитело сопровождается изменением оптической плотности среды (помутнением) — преципитацией (от лат. praecipitatio — падение вниз), что расценивают как положительный результат реакции.

Антиген для РП готовят из чистых культур микроорганизмов, если антиген предназначен для серодиагностики, или из тканевого материала, содержащего микроорганизмы, если РП ставят, чтобы при помощи известной иммунной сыворотки обнаружить возбудитель в патологическом материале.

Физические методы экстрагирования антигенов основаны на механическом разрушении микробных клеток посредством растирания с кварцевым песком, встряхивания на шюттель — аппарате в колбе со стеклянными шариками, многократного замораживания и оттаивания или воздействия ультразвуком. Полисахаридные термостойкие антигены выделяют термической обработкой (кипячением, автоклавированием).

Из химических методов получения антигенов достаточно широко используют экстрагирование трихлоруксусной кислотой (полный антиген Буавена); кислотный или щелочной термогидролиз — прогревание материала, например, в 1%-м растворе уксусной кислоты или 0,1 н. растворе гидроксида натрия; экстрагирование при помощи ацетона, мочевины, этилового спирта, эфира и других растворителей; часто применяют различные детергенты — дезоксихолат натрия, лаурилсульфат натрия и т. д.; используют методы ферментативного разрушения микробных клеток, например, посредством воздействия трипсином.

Выбор того или иного способа выделения растворимого антигена зависит от его химической природы. Главное требование к любому из методов — эффективное извлечение антигена без его денатурации.

На основе феномена преципитации разработаны реакция кольцепреципитации (РКП), радиальной иммунодиффузии; принцип реакции преципитации использован в иммуноэлектрофорезе и встречном иммуноэлектрофорезе.

Реакция кольцепреципитации (РКП). Известна по имени автора как реакция Асколи (1911); разработана для диагностики сибирской язвы. РКП используют на практике преимущественно для выявления микробных антигенов в тканевом материале. Обязательное условие постановки РКП — прозрачность раствора антигена и иммунной сыворотки, поэтому при необходимости компоненты реакции освобождают от взвешенных частиц фильтрованием, например, через асбестовую вату.

Техника постановки РКП включает в себя три варианта.

Метод «наслаивания» антигена. В уленгутовские пробирки (диаметр 2–3 мм) вносят пастеровской пипеткой с тонким капилляром, не смачивая стенок пробирки, 0,3–0,4 мл иммунной преципитирующей сыворотки. Затем по стенке пробирки осторожно наслаивают на поверхность сыворотки 0,1–0,2 мл растворимого исследуемого антигена (преципитиногена). Смешивания компонентов не происходит благодаря различию плотности сыворотки и экстракта.

Учет результатов проводят на фоне темной бумаги. Через 1–2 мин в зоне взаимной диффузии антигена и антител, на границе контакта компонентов, происходит помутнение среды, видимое сбоку как серо-дымчатый диск (преципитат).

Метод «подслаивания» антител. В пробирку вначале вносят антиген, а затем осторожно при помощи пастеровской пипетки на дно пробирки, под антиген, «подслаивают» иммунную сыворотку.

При постановке кольцевой РП в ходе исследования тканевого материала необходимы следующие контроли:

1. Иммунная сыворотка + стандартный антиген;

2. Иммунная сыворотка + физиологический раствор;

3. Иммунная сыворотка + экстракт из тканей здоровых животных.

Показания РП считают достоверными, если в первом контроле получают положительный, а в остальных — отрицательный результат.

Микровариант РКП. Разработан для экономии компонентов. В этом случае используют стеклянные капилляры или тонко оттянутые кончики пастеровских пипеток диаметром 0,5–1,0 мм. Капилляр опускают одним концом во флакон с преципитирующей сывороткой, набирают его на высоту 1,0–1,5 см, закрывают верхнее отверстие капилляра указательным пальцем. Затем ватой удаляют излишек сыворотки с наружной стороны капилляра, погружают его в раствор антигена и набирают равное количество антигена. Капилляр переворачивают с таким расчетом, чтобы смесь сыворотки и антигена оказалась в середине капилляра, после чего закрепляют вертикально в пластилиновой пластинке. Результаты учитывают, как и при обычной РКП.

Реакция диффузионной преципитации (РДП). Основана на встречной диффузии антител (иммунной сыворотки) и растворимых антигенов в агаровом геле (двойная диффузия). Если антиген состоит из смеси моноантигенов, то каждый из них диффундирует с различной скоростью и точки эквивалентных соотношений каждого антигена и гомологичных антител будут находиться в различных участках агарового геля, где и формируется преципитат в виде линий. Таким образом, каждая пара антиген — антитело образует свою линию преципитации. При помощи РДП можно анализировать сложные антигенные смеси, поскольку каждый антиген дает свою линию преципитации. В ряде случаев РДП используют как метод серологической диагностики инфекционных болезней.

Из очищенного агара фирмы «Дифко» готовят 1,5%-ный раствор агара в физиологическом растворе (рН 7,2–7,4) с добавлением мертиолата (конечное разведение 1:10 000) как консерванта.

На хорошо обезжиренное стекло, лежащее строго горизонтально, наливают расплавленный агар в количестве, достаточном для формирования слоя геля толщиной 3–4 мм. Затем штампами вырезают лунки в агаровом геле; агар из лунки удаляют с помощью трубочек. На дно лунки наносят каплю горячего агара с последующим его удалением, что создает «дно» лунки и предотвращает подтекание компонентов под гель.

В зависимости от конкретной задачи применяют штампы с различным количеством пробойников, обеспечивающие получение лунок разного диаметра и на разном расстоянии. При изучении неизвестных реагентов оптимальное расстояние между лунками необходимо установить в предварительных опытах. В зависимости от конкретной задачи в центральную лунку вносят иммунную сыворотку, в периферические — анализируемые антигены или наоборот. Сыворотка и антиген не должны выходить за пределы лунки на поверхность агара. Затем пластины помещают в эксикатор. На дно эксикатора наливают небольшое количество воды с антисептиком. Пластины с компонентами выдерживают при комнатной температуре 10–72 ч.

Учет результатов: полосы преципитации образуются только в зоне эквивалентности т. е. там, где все антитела связаны с антигеном (если в жидкой среде соединить эквивалентные количества реагентов, то в надосадочной жидкости после формирования препитата не будет свободных антигена и антител).

При изучении в РДП различных антигенов возможны три варианта результата реакции.

1. Реакция идентичности: слияние линий преципитации, относящихся к двум соседним антигенам (у сравниваемых антигенов гомологичные детерминаты — антигены оценивают как идентичные).

2. Реакция неидентичности: пересечение линий преципитации (у сравниваемых антигенов нет гомологичных антигенных детерминант).

3. Реакция неполной идентичности: неполное пересечение линий преципитации с формированием так называемой «шпоры». Такая картина возникает, когда у одного из антигенов помимо гомологичных есть и специфические детерминанты, которые второй антиген в составе своей молекулы не несет.

С помощью реакции диффузионной преципитации можно обнаруживать антитела в сыворотке крови и определять их титр. В этом случае в центральную лунку вносят известный растворимый антиген (бактериальный, вирусный), а в периферические — различные разведения исследуемой сыворотки крови.

Чтобы полосы преципитации стали более выраженными, пластины обрабатывают слоями кадмия: пластины с готовым гелем отмывают в физиологическом растворе и заливают 0,65%-м раствором сульфата кадмия. В результате через несколько минут полосы преципитации становятся более ярко выраженными (в несколько раз).

В практике для постановки РДП при контроле кожевенно-мехового сырья на ниличие возбудителя сибирской язвы поступают следующим образом. Готовят экстракты на наличие антигена (кусочки кожмехсырья с бирками автоклавируют, измельчают, карболинизируют, гомогенизируют, экстрагируют, фильтруют). В чашках Петри с агаром Дифко (или другим очищенным прозрачным агаром) стеклянными трубочками делают лунки (одну центральную и несколько периферических). В центральную луночку вносят диагностическую сибиреязвенную сыворотку, в периферические — экстракты на наличие антигена. Учет реакции через 24–48 часов. При положительном результате на границе диффузии двух компонентов образуется полоска («усики») преципитата.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Идентифицировать культуры эшерихий и сальмонелл в РА на стекле с О-агглютинирующими сыворотками.

Задание 2. Определить титр положительной бруцеллезной сыворотки в пробирочной РА.

Задание 3. Поставить РБП с позитивными и негативными бруцеллеными сыворотками.

Задание 4. Учесть результаты титрования позитивной сыворотки в РНГА.

Задание 5. Освоить технику постановки и учета результатов кольцевой РП.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие типы антигенов используют в РА?

2. В чем сущность феномена агглютинации?

3. Что такое качественная и количественная РА?

4. Каким образом неизвестный микроорганизм идентифицируют в РА?

5. В чем сущность феномена преципитации?

6. Какова техника постановки кольцевой РП и РДП?

Глава 2.2. Реакция связывания комплемента (РСК)

2.2.1. Цель занятия

Ознакомиться с принципом, техникой постановки реакции связывания комплемента. Ее значение в диагностике особо опасных инфекционных болезней животных. Провести самостоятельно главный опыт РСК по готовым материалам, представленным в лаборатории кафедры.

2.2.2. Материалы и оборудование

Физиологический раствор, 2,5%-ная суспензия эритроцитов барана в физиологическом растворе, бруцеллезный антиген, положительная бруцеллезная сыворотка, нормальная сыворотка крупного рогатого скота, комплемент морской свинки, гемолизин, мерные пипетки на 1,5 мл, водяная баня.

2.2.3. Теоретический материал

РСК применят как метод серологической диагностики и реже для обнаружения микробных антигенов в исследуемом материале. В РСК с одинаковым успехом можно использовать корпускулярные и растворимые антигены. В РСК участвуют две системы: бактериолитическая, которая служит основной, диагностической и гемолитическая, которая является индикаторной системой (показывает, произошла ли реакция в основной в бактериолитической системе).

Комплемент в РСК берется в количестве необходимом либо для лизиса бактериального антигена, либо для лизиса эритроцитов барана.

Комплемент не способен соединяться с антигеном (АГ) или с антителами (АТ) в отдельности, но реагирует с образовавшимся комплексом АГ АТ.

Гемолитическая система — состоит из эритроцитов барана (антиген) и гемолизина (антитела к эритроцитам барана). При взаимодействии комплемента с системой АГ АТ наблюдают процесс иммунного лизиса эритроцитов. На конкуренции исследуемой и индикаторной систем АГ АТ за комплемент основана диагностическа РСК. Рассмотрим ее принцип на модели обнаружения антител в исследуемой сыворотке при помощи известного антигена.

РСК ставят в два этапа. Сначала в пробирку вносят исследуемую сыворотку крови, известный антиген и комплемент. Смесь реагентов выдерживают в водяной бане при 37 °С 20–30 мин Независимо от результата видимых изменений в пробирке не происходит (первая фаза РСК). Чтобы выяснить результат, в пробирку вносят индикаторную систему (вторая фаза РСК). После инкубирования всех компонентов учитывают результаты. Возможны два варианта результатов.

Компоненты РСК. При введении всех компонентов в строго определенном количественном соотношении реакция дает достоверные и воспроизводимые результаты:

а) солевой раствор для разведения компонентов: используют физиологический раствор.

б) эритроциты барана: эритроциты дефибринированной крови барана отмывают физиологическим раствором (2500 об/мин три раза по 5 мин). В реакции обычно используют 2,5%-ную взвесь. При необходимости длительного использования ее хранят в растворе Ольсвера: хлорид натрия — 4,2 г, лимонная кислота — 0,55 г, нитрат натрия — 8 г, декстроза — 20,5 г, дистиллированная вода — 10 мл (рН 6,1). Раствор стерилизуют автоклавированием и смешивают с кровью в соотношении 1:2. Эритроциты, хранящиеся на растворе Ольсвера при 4–6 °С, можно использовать до 40 сут.

в) гемолизин выпускают биофабрики. Представляет собой сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана, содержащую антитела к эритроцитам. На коробках с гемолизином указывают его активность в виде титра, определенного в реакции иммунного лизиса.

г) комплемент — сыворотка крови морской свинки. Биофабрики выпускают комплемент в лиофилизированном виде (срок годности 1 год). В случае необходимости комплемент можно получить пункцией сердца морской свинки при помощи шприца с иглой.

д) антиген: диагностические антигены для РСК готовят на биофабриках. На коробках с антигеном указывают его активность (титр антигена) в виде разведения, рекомендованного для использования в РСК.

е) диагноститческая или исследуемая сыворотка. Перед постановкой опыта ее инактивируют в водяной бане при температуре 56–58 °С, чтобы разрушить собственный комлемент.

Главный опыт РСК. Кроме исследуемых сывороток крови при постановке основного опыта РСК в качестве контрольных используют положительную и отрицательную сыворотки крови. Схема главного опыта показана в табл. 2.2.3.1.

Таблица 2.2.3.1

Главный опыт РСК

Компонент | Количество компонента (мл) в пробирке
1-й | 2-й | 3-й | 4-й | 5-й | 6-й | 7-й
Исследуемая сыворотка крови, разведенная 1:5 (1:10) | 0,2 | – | – | 0,2 | – | – | –
Положительная сыворотка | – | 0,2 | – | – | – | – | –
Отрицательная сыворотка | – | – | 0,2 | – | – | – | –
Антиген в рабочем титре | 0,2 | 0,2 | 0,2 | – | 0,2 | – | –
Физиологический раствор | – | – | – | 0,2 | 0,2 | 0,4 | 0,6
Комплемент в рабочем титре | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | –
Инкубирование при 37 °C 20 мин или при 0–2 °C 18–20 ч*
Эритроциты, 2,5%-ная суспензия | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2
Гемолизин в рабочем титре | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2

*Если первый этап РСК проводят при 0–4 °C 18–20 ч, то реакцию называют РДСК — реакция длительного связывания комплемента. РДСК более чувствительна, чем РСК.

Результат РСК учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в пробирках и выражают в крестах:

1) (++++) — полная задержка гемолиза (после оседания эритроцитов жидкость прозрачная);

2) (+++) — задержка гемолиза сильно выражена (после оседания эритроцитов жидкость слабо-розового цвета);

3) (++) — частичная задержка гемолиза (после оседания эритроцитов жидкость интенсивно окрашена в красный цвет);

4) (+) — слабая задержка гемолиза (незначительный осадок эритроцитов, жидкость интенсивно окрашена);

5) (–) — полный гемолиз, осадка эритроцитов нет.

Как положительный результат РСК оценивают задержку гемолиза минимум на два креста и более.

Учет результатов начинают с контрольных пробирок:

7-я пробирка — контроль физиологического раствора: гемолиза не должно быть;

6-я пробирка — контроль индикаторной системы и комплемента: должен быть полный гемолиз;

5-я пробирка — контроль антигена: должен быть полный гемолиз;

3-я пробирка — контроль с отрицательной сывороткой: должен быть полный гемолиз;

2-я пробирка — контроль с положительной сывороткой: должна быть задержка гемолиза.

Если все перечисленные контроли свидетельствуют о правильности приготовления компонентов реакции и выборе их доз, приступают к учету результатов РСК с исследуемой сывороткой крови.

Первоначально учитывают результаты в 4-й пробирке (безантигенный ряд) — контроль антикомплементарности сыворотки.

При полном гемолизе в 4-й пробирке (отсутствие антикомплементарности) можно учитывать результат в 1-й пробирке (антигенный ряд), где результат может варьирировать от полного гемолиза (отрицательный результат) до полной задержки гемолиза (положительный результат). Если исследуемая сыворотка антикомплементарна, то результат в первой пробирке учитывать нельзя и от этого животного необходимо брать кровь для повторного исследования.

Окончательный учет результатов РСК проводят через 18–20 ч, за это время нелизированные эритроциты оседают на дно пробирки.

В приведенном примере рассмотрен вариант постановки РСК в объеме 1 мл, когда каждый компонент взят в объеме 0,2 мл. Возможна постановка РСК в макроварианте (2,5 мл) или в капельном варианте.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с компонентами РСК, сущностью и постановкой главного опыта РСК.

Задание 2. Провести самостоятельно учет результата РСК.

Задание 3. 3арисовать в тетради для самостоятельной работы полученный результат готового главного опыта РСК.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Что представляет собой комплемент морской свинки? Как его консервируют?

2. Какие две системы участвуют в РСК?

3. Какие компоненты участвуют в РСК?

4. Почему перед постановкой реакции инактивируют исследуемую сыворотку?

5. На чем основано получение гемолизина?

6. В чем сущность иммунного гемолиза?

7. Что такое титр и рабочий титр гемолизина и комплемента?

8. Какова схема главного опыта РСК?

9. Для чего используют РСК?

10. Как учитывается результат РСК и какой гемолиз считается положительным?

11. Как оценивается правильность приготовления компонентов реакции РСК по контрольным пробиркам?

Глава 2.3. Метод флуоресцирующих антител (МФА). Реакция нейтрализации (РН)

2.3.1. Цель занятия

Ознакомиться с принципом метода флуоресцирующих антител, с реакцией нейтрализации (РН). Освоить технику постановки РН для обнаружения и идентификации бактериальных токсинов.

2.3.2. Материалы и оборудование

Инактивированные культуры бруцелл и сальмонелл, 96%-й этанол, ФСБР (рН 7,2–7,4), «влажная камера» (чашки Петри, эксикатор), люминесцирующие сыворотки против бруцелл, сальмонелл, иммуноглобулинов кролика, позитивная бруцеллезная сыворотка, люминесцентный микроскоп.

Бульонные токсиносодержащие культуры Clostridium perfringens, центрифуга, центрифужные пробирки, стерильные бактериологические пробирки, стерильный физиологический раствор, воронки, ватно-марлевые фильтры, стерилизатор со шприцами и инъекционными иглами, диагностические антитоксические сыворотки Cl. perfringens, белые мыши массой 16–18 г.

2.3.3. Теоретический материал

В названных серологических реакциях используют антитела (иммунные сыворотки), меченные флуорохромом или ферментами, и в дальнейшем, применяя специальные методы, регистрируют образование комплекса антиген — антитело.

Реакцию нейтрализации относят к иммунологическим реакциям, например, учитывают потерю биологической активности антигена при взаимодействии с гомологичными антителами. Если антигеном служит бактериальный экзотоксин, то он теряет свои токсические свойства (нейтрализуется), вирус как антиген теряет в этом случае инфекционное действие и т. д. В бактериологических диагностических исследованиях наиболее часто используют РН как метод обнаружения и идентификации бактериальных токсинов.

Метод флуоресцирующих антител (МФА)

Этот комплексный метод сочетает в себе серологическую реакцию, при которой происходит специфическое взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунного комплекса, и микроскопическое исследование, с помощью которого этот комплекс обнаруживают.

В реакции иммунофлуоресценции используют антитела, к которым присоединен флуорохром (чаще флуоресцеин — изотиоцинат). Такие антитела сохраняют способность специфически реагировать с антигеном и благодаря флуорохрому светиться под действием ультрафиолетовых лучей. При постановке МФА микробный антиген фиксируют на предметном стекле и обрабатывают люминесцирующими антителами. Затем препарат отмывают водой от несвязавшихся антител и просматривают в люминесцентном микроскопе. Если антитела специфически соответствуют данному антигену, то они образуют с антигеном прочный комплекс и при люминесцентной микроскопии в препарате обнаруживают светящиеся микробные клетки.

Преимущество МФА как диагностического метода состоит в том, что с его помощью возможно за два-три часа серологически идентифицировать микроорганизм непосредственно в патологическом материале, без выделения в чистой культуре (экспресс-метод). Как и другие серологические реакции, МФА применяют и для выявления антител в крови животных.

Приготовление препарата для МФА. При выявлении возбудителя инфекции (антигена) на предметном стекле готовят мазки-отпечатки из органов или другого материала. Чтобы обнаружить антитела в исследуемой сыворотке крови, на предметном стекле готовят мазки из известного антигена, например возбудителя сальмонеллеза, сибирской язвы и др. Препарат с нанесенным материалом (бактериальная суспензия, мазок-отпечаток) подсушивают на воздухе и фиксируют ацетоном (5 мин), или этанолом (10–15 мин), или метанолом (5–10 мин). Препарат можно фиксировать и нагреванием, как при обычной световой микроскопии. Мазки-отпечатки из органов и тканей лучше обрабатывать охлажденным до –20 °C ацетоном 2–4 мин В зависимости от конкретных задач окрашивание готовых препаратов люминесцирующими сыворотками проводят различными способами.

Прямой МФА

Разработал Coons с соавт. (1950). На предметное стекло с фиксированным антигеном наносят каплю люминесцирующей иммунной сыворотки в рабочем разведении, содержащей антитела против искомого антигена. Чтобы избежать высыхания, препарат помещают во влажную камеру (чашки Петри) с фильтровальной бумагой, смоченной водой, и выдерживают в термостате при 37–38 °C, 15–30 мин Затем препарат 5–10 мин промывают от не связавшихся иммуноглобулинов проточной (водопроводной) водой, рН не ниже 7,0. Промытый препарат высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Прямой МФА используют только для идентификации неизвестного антигена; к его недостатку относят необходимость приготовления люминесцирующей сыворотки для каждого вида идентифицируемого микроорганизма.

Непрямой МФА

Применяют в двух вариантах.

Двухступенчатый МФА предложили Weller и Coons (1954). Этот вариант считают более универсальным, так как при помощи одной люминесцирующей антивидовой сыворотки можно выявлять различные виды микроорганизмов.

На антиген наносят каплю немеченной иммунной сывороки (сыворотка первой ступени). Препарат выдерживают в термостате 15–30 мин, затем его промывают, чтобы удалить несвязавшиеся антитела иммунной сыворотки, и просушивают (см. прямой вариант). Если антитела сыворотки первой ступени соответсвуют антигену, то вода не вымывает образовавшийся АГ — АТ-комплекс (антитела зафиксированы на антигене).

На подсушенный препарат наносят каплю люминесцирующей антивидовой сыворотки (сыворотка второй ступени) в рабочем титре. Препарат повторно помещают в термостат во влажной камере на 15–30 мин, затем промывают водой и подсушивают. Антивидовая сыворотка представляет собой меченные флурохромом антитела против иммуноглобулинов крови животного того вида, от которого получена иммунная сыворотка первой ступени. Таким образом, антитела первой сыворотки служат антигеном для меченных антител антивидовой сыворотки. В результате к образовавшемуся на первом этапе АГ — АТ-комплексу присоединяются антитела второй ступени, образуется двойной комплекс, который можно обнаружить в люминесцентном микроскопе.

Универсальность непрямого варианта обусловлена тем, что, используя на первом этапе полученные от животных одного вида (например, от лошадей) иммунные сыворотки против различных микроорганизмов, на втором этапе с помощью одной антивидовой сыворотки можно идентифицировать неограниченное количество возбудителей инфекционных болезней.

Трехступенчатый МФА представляет собой вариант РСК на стекле. В данном случае в иммунном комплексе на стекле при помощи люминесцирующей сыворотки выявляют связанный комплемент.

Двухступенчатым или трехступенчатым МФА при использовании известного антигена можно обнаруживать антитела в крови животных.

Для подтверждения специфичности результатов МФА необходимы контроли. Для прямого варианта достаточно одного контроля: гомологичные и гетерологичные в антигенном отношении микроорганизмы обрабатывают люминесцирующей сывороткой. В первом случае наблюдают свечение бактерий, во втором свечение отсутствует.

Для непрямого варианта ставят два контроля: 1) мазки, содержащие гомологичные и гетерологичные в антигенном отношении микроорганизмы, обрабатывают антивидовой люминесцирующей сывороткой. При отсутствии антител первой ступени клетки не должны люминесцировать; 2) мазки с гомологичными и гетерологичными в антигенном отношении бактериями обрабатывают иммунной (антимикробной) сывороткой (первый этап) с последующим нанесением флуоресцирующей антиглобулиновой (антивидовой) сыворотки (первый этап). Специфическое свечение бактерий наблюдают в первом случае, во втором оно отсутствует.

Оценка результатов МФА. Учитывают яркость свечения, цвет, локализацию и структуру свечения. У бактерий, окрашенных (обработанных) люминесцирующей сывороткой, меченной изоцианатом флуоресцеина, обычно наблюдают яркое зеленое свечение по периферии клетки в виде ободка или ореола, центральная часть бактерии светится слабо. Такой характер свечения объясняют тем, что с единицы площади по периферии микробной клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в несколько раз больше антител, чем с центральной ее части. Следует учитывать, что у пластичных бактерий (лептоспиры, вибрионы) светится вся клетка. У клеток, погруженных в тканевую жидкость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен слабо.

Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой системе:

1) (++++) — очень яркая флуоресценция по переферии микробной клетки, четко контрастирующая с темной центральной частью клетки;

2) (+++) — яркая флуоресценция периферии клетки;

3) (++) — слабое свечение периферии клетки;

4) (+) — нет контрастного свечения периферии и центральной части микробной клетки.

Отсутствие специфического свечения обозначают знаком «минус» (видны тени микроорганизмов). При диагностике различных возбудителей болезней положительным результатом чаще считают специфическое свечение бактериальных клеток не ниже, чем на четыре или три креста.

РН бактериального экзотоксина

Используют при диагностике таких бактериозов, как ботулизм, инфекционная энтеротоксемия овец и др., возбудители которых (Clostridium botulinum, Clostridium perfringens) синтезируют сильный экзотоксин. Для постановки диагноза на эти бактериальные инфекции достаточно обнаружить экзотоксин в РН. Для постановки РН необходимы диагностические иммунные сыворотки, содержащие антитела к определенному бактериальному токсину — антитоксические сыворотки. Такие диагностические сыворотки получают путем гипериммунизации животных-продуцентов анатоксинами, токсинами инактивированными (формальдегидом), но сохранившими свои иммуногенные свойства. Например, Clostridium perfringens продуцирует шесть типов экзотоксинов, различающихся по антигенной структуре (A, В, С, D, E, F).

Исследуемый материал, в котором предположительно находится токсин (содержимое кишечника), разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1, экстрагируют при комнатной температуре 1 ч, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и центрифугируют при 5000 об/мин — 20 мин Надосадочную жидкость вводят внутрибрюшинно или внутривенно по 0,5 мл двум белым мышам массой 16–18 г. При наличии токсина в исследуемом материале животные погибают в течении 12 ч. После обнаружения токсина его идентифицируют в реакции нейтрализации. Схема постановки РН на примере определения типа токсина Clostridium perfringens показана в табл. 2.3.3.1. Диагностические антитоксические сыворотки (типов A, С, D, E) предварительно разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 10 ед/мл.

Содержимое каждой пробирки после инкубирования вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 0,5 мл двум белым мышам. Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч. Если токсин принадлежит Clostridium perfringens, то мыши, получившие смесь токсина с гомологичной антитоксической сывороткой, остаются живы (табл. 2.3.3.2).

Таблица 2.3.3.1

Схема постановки РН на примере определения типа токсина Clostridium perfringens

Компонент | Количество компонента (мл) в пробирке
Фильтрат исследуемого материала | 1-й | 2-й | 3-й | 4-й | 5-й
Диагностические антитоксические сыворотки | 1(А) | 1(С) | 1(D) | 1(Е) | –
Физиологический раствор | – | – | – | – | 1
Инкубируют при 37 °С 30 мин

Таблица 2.3.3.2

Учет результатов РН на примере определения типа токсина Clostridium perfringens

Тип токсина | Антитоксическая сыворотка | Контроль
А | С | D | Е
А | – | х | х | х | +
В, С, F | + | – | + | + | +
D | + | + | – | + | +
Е | + | + | + | – | +

Примечание: (+) — мыши пали; (–) — мыши живы; (×) — результат не учитывают.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Идентифицировать культуры возбудителей бруцеллеза и сальмонеллеза прямым МФА.

Задание 2. Идентифицировать двухступенчатым МФА культуру сальмонелл.

Задание 3. Освоить технику постановки реакции нейтрализации по выявлению и идентификации токсинов Clostridium perfringens.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. В чем сущность одноступенчатого, двухступенчатого и трехступенчатого МФА?

2. Как осуществляется приготовление препарата для исследования МФА?

3. Для каких целей используют МФА?

4. В чем преимущества МФА как диагностического метода?

5. В чем преимущества и недостатки прямого МФА?

6. В чем сущность реакции нейтрализации?

7. Какие применяют варианты реакции нейтрализации?

8. Каким образом устанавливают тип бактериального токсина в РН?

Глава 2.4. Клетки, участвующие в иммунном ответе. Методы фракционирования, идентификации иммуноцитов и розеткообразования

2.4.1. Цель занятия

Изучить роль и значение клеток, участвующих в иммунном ответе. Приобрести теоретические знания и практические навыки для выделения мононуклеаров из цельной крови и проведения реакции розеткообразования.

2.4.2. Материалы и оборудование

1. Раствор феколл-верографина (для выделения лимфоцитов):

— приготовление 33,8%-ного верографина: к 33,9 мл 76%-ного раствора верографииа добавляют 42,1 мл ди- или тридистиллированной воды (плотность 1,200 г/мл);

— приготовление 9%-ного фиколла: 10,8 г фиколла растворить в 109,2 мл подогретой до 37 °С воды (плотность 1,025 г/мл);

— смешивают 7 частей верографина (33,8%) и 16 частей фиколла (9%), плотность измеряют ареометром (1,077 г/мл). К верографину добавляют фиколл, а не наоборот.

2. Фосфатно-солевой буфер (РBS, 1 литр):

— Раствор А — 14,3 г Na₂НРО₄ (двузамещ.) в 1 л дистиллированной воды.

— Раствор В — 13,7 г КН₂РО₄ (однозамещ.) в 1 л дистиллированной воды. Смешивают 85,2 мл раствора А и 14,8 мл раствора В, добавляют 8,75 г NаСl и доводят до 1 л дистиллированной водой (рН 7,2).

3. Центрифуга. Раствор Хенкса, или среда 199.

2.4.3. Теория вопроса

Все клетки гемопоэтического происхождения образуются из стволовых клеток, дающих начало клеткам двух основных направлений кроветворения: лимфоидного и миелоидного. В зависимости от микроокружения клетка-предшественник лимфоидного ряда может дифференцироваться либо в Т-, либо в В-клетку. У млекопитающих Т-клетки созревают в тимусе, тогда как В-клетки развиваются вначале в печени плода, а после рождения в костном мозге (у птиц в сумке Фабрициуса).

Нормальные клетки-киллеры (НК) — большие бластные, гранулярные лимфоциты. Они не имеют антигенраспознающих рецепторов, поэтому не являются специфическими клеточными факторами иммунитета. Их участие в иммунном процессе — неспецифическое разрушение чужеродных клеток (некоторых опухолевых клеток, вирусинфицированных клеток, неродственных трансплантатов). Предшественники клеток миелоидного ряда дифференцируются в зрелые (коммитированные) клетки, изображенные слева (рис. 2.4.3.1). Эозинофилы, нейтрофилы и базофилы объединены под групповым названием гранулоциты (рис. 2.4.3.2).

Из анализа поверхностных молекулярных структур (рецепторов, маркеров), определяемых с помощью моноклональных антител, лимфоциты делят на отдельные популяции и субпопуляции. Все обнаруженные антигенные специфичности объединены под общим названием CD-антигены. Извесно более 150 таких кластеров. Изучая динамику появления CD-антигенов удалось не только четко разделить все лимфоциты на популяции и субпопуляции, но и проследить процессы дифференцировки лимфоцитов, изменение поверхностных клеточных структур в результате выполнения той или иной функции и выявить предназначение самих CD-антигенов в процессах становления и развития клеточных участников иммунного ответа.

Т-лимфоциты — локализуются в Т-зависимых зонах периферических лимфоидных органов (периваскулярные лимфоидные муфты селезенки, паракортикальные зоны лимфатических узлов). Клетки — предшественники Т-лимфоцитов (пре-Т-лимфоциты) из костного мозга попадают в тимус, где созревают, пролиферируют и проходят дифференцировку на отдельные субклассы в результате взаимодействия с эпителиальными и дендритными клетками стромы и воздействия гормоноподобных полипептидных факторов, секретируемых эпителиальными клетками тимуса (альфа1 тимозин, тимопоэтин, тимулин и др.). При дифференцировке Т-лимфоциты приобретают определенный набор мембранных CD-маркеров. Т-клетки разделяют на субпопуляции в соответствии с их функцией и профилем CD-маркеров. Выделяют три основные группы Т-лимфоцитов.

Первая группа — помощники (активаторы), в состав которых входят Т-хелперы1, Т-хелперы2, индукторы Т-хелперов, индукторы Т-супрессоров.

1. Т-хелперы 1 несут рецепторы CD4 (как и Т-хелперы2) и CD44, отвечают за созревание Т-цитотоксических лимфоцитов (Т-киллеров), активируют Т-хелперы2 и цитотоксическую функцию макрофагов, секретируют ИЛ-2, ИЛ-3 и другие цитокины.

2. Т-хелперы2 имеют общий для хелперов CD4 и специфический CD28 рецепторы, обеспечивают пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов в антителопродуцирующие (плазматические) клетки, синтез антител, тормозят функцию Т-хелперов1, секретируют ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6.

3. Индукторы Т-хелперов несут CD29, отвечают за экспрессию антигенов HLA класса 2 на макрофагах и других А-клетках.

4. Индукторы Т-супрессоров несут CD45 специфический рецептор, отвечают за секрецию ИЛ-1 макрофагами, активацию дифференцировки предшественников Т-супрессоров.

Вторая группа — Т-эффекторы. В нее входит только одна субпопуляция.

5. Т-цитотоксические лимфоциты (Т-киллеры). Имеют специфический рецептор CD8, лизируют клетки-мишени, несущие чужеродные антигены или измененные аутоантигены (трансплантант, опухоль, вирус и др.). ЦТЛ распознают чужеродный эпитоп вирусного или опухолевого антигена в комплексе с молекулой класса 1 HLA в плазматической мембране клетки-мишени.

Третья группа — Т-клетки-регуляторы. Представлена двумя основными субпопуляциями.

6. Т-супрессоры имеют важное значение в регуляции иммунитета, обеспечивая подавление функций Т-хелперов 1 и 2, В-лимфоцитов. Имеют рецепторы CD11, CD8. Группа функционально разнородна. Их активация происходит в результате непосредственной стимуляции антигеном без существенного участия главной системы гистосовместимости.

7. Т-контсупрессоры. Не имеют CD4, CD8, имеют рецептор к особому лейкину. Способствуют подавлению функций Т-супрессоров, вырабатывают резистентность Т-хелперов к эффекту Т-супрессоров.

В-лимфоциты. Существует несколько подтипов В-лифоцитов. Основная функция В-клеток — эффекторное участие в гуморальных иммунных реакциях, дифференциация в результате антигенной стимуляции в плазматические клетки, продуцирующие антитела.

Дифференцировка В-лимфоцитов

Антиген — независимая фаза. В-лимфоцит в процессе созревания проходит стадию пре-В-лимфоцита — активно пролиферирующей клетки, имеющей цитоплазменные H-цепи (IgM).

Следующая стадия — незрелый В-лимфоцит характеризуется появлением мембранного (рецепторного) IgM на поверхности. Конечная стадия антигеннезависимой дифференцировки — образование зрелого В-лимфоцита, который может иметь два мембранных рецептора с одинаковой антигенной специфичностью (изотипа) — IgM и Ig D. Зрелые В-лимфоциты покидают костный мозг и заселяют селезенку, лимфоузлы и другие скопления лимфоидной ткани, где их развитие задерживается до встречи со «своим» антигеном, т. е. до осуществления антиген-зависимой дифференцировки.

Антиген-зависимая дифференцировка включает активацию, пролиферацию и дифференцировку В-клеток в плазматические клетки и В-клетки памяти. Активация осуществляется различными путями, что зависит от свойств антигенов и участия других клеток (макрофагов, Т-хелперов). Большинство антигенов, индуцирующих синтез антител, для индукции иммунного ответа требуют участия Т-клеток — тимус-зависимые антигены. Тимус-независимые антигены (ЛПС, высокомолекулярные синтетические полимеры) способны стимулировать синтез антител без помощи Т-лимфоцитов. В-лимфоцит с помощью своих иммуноглобулиновых рецепторов распознает и связывает антиген. Одновременно с В-клеткой антиген, по представлению макрофага, распознается Т-хелпером (Т-хелпером 2), который активируется и начинает синтезировать факторы роста и дифференцировки. Активированный этими факторами В-лимфоцит претерпевает ряд делений и одновременно дифференцируется в плазматические клетки, продуцирующие антитела.

Мононуклеарные фагоциты — это моноциты циркулирующей крови, клетки Купфера в печени, мезангиальные клетки почек, альвеолярные макрофаги легких, макрофаги серозных полостей, микроглия мозга, селезеночные синусные макрофаги и синусные макрофаги лимфоузла.

Выполняют две основные функции: а) «профессиональные макрофаги» — устранение корпускулярных антигенов, б) антигенпрезентирующие клетки — поглощение, процессинг и представление антигена Т-клеткам. Моноциты и макрофаги способны активно фагоцитировать микроорганизмы и даже опухолевые клетки in vitro. При связывании специализированных моноцитарных рецепторов с микробными клетками происходит их адгезия и поглощение моноцитами. Эти рецепторы взаимодейстуют с определенными углеводами в составе клеточных стенок микробов либо с IgG и компонентами комплемента, опсонизировавшими их поверхность.

Гранулоциты (нейтрофил, эозинофил, базофил) — не обладают какой-либо врожденной антигенной специфичностью, но им принадлежит важнейшая роль в острой защитной воспалительной реакции на инфекцию —фагоцитозе.

Нейтрофилы — обладают большим набором антибиотических белков, которые хранятся в гранулах двух типов. Первичные (азурофильные) гранулы — это лизосомы, содержащие кислые гидролазы, миелопероксидазу и мурамидазу (лизоцим). Во вторичных (специфических) гранулах дополнительно к лизоциму обнаружен лактоферрин. Кроме ферментов и лактоферрина в этих гранулах содержатся в высоких концентрациях антибиотические белки — дефензины, сепроцидины, кателицидины и белок, индуцирующий проницаемость бактериальных клеток. Фагоцитированные нейтрофилами микробы находятся в вакуолях (фагосомы), которые сливаются с лизосомами, превращаясь в фаголизосом. При активации иммунными комплексами, опосредованной Fcγ-рецепторами, нейтрофилы способны также высвобождать содержимое гранул и цитотоксические соединения во внеклеточное пространство (вполне возможно, что этот механизм лежит в основе болезней иммунных комплексов (гиперчувствительность III типа).

Эозинофилы — способны фагоцитировать и уничтожать поглощенные микробные клетки, хотя это и не относится к их прямым функциям. Гранулы зрелых эозинофилов — это окруженные мембранами клеточные органеллы с «кристалловидной» сердцевиной, заметные на фоне окружающего матрикса благодаря их высокой электронной плотности. Определенные стимулы вызывают дегрануляцию эозинофилов, т. е. слияние гранул с цитоплазматической мембраной и высвобождение их содержимого во внеклеточную среду. Реакция дегрануляции — это один из механизмов использования эозинофилами токсичного содержимого своих гранул для уничтожения крупных мишеней, которые не поддаются фагоцитозу. Другой механизм состоит в образовании токсичных реакционноспособных метаболитов кислорода. Оба механизма вероятно составляют основу противогельминтного иммунитета, в котором, как предполагается, эозинофилам принадлежит особая роль. Привлечение эозинофилов к месту инвазии паразита происходит за счет высвобождения Т-клетками, тучными клетками и базофилами особых продуктов, таких как анафилактический фактор хемотаксиса эозинофилов (ФХЭ-А). Они связываются с поверхностью мишени, опсонизированной специфичными антителами изотипа IgG или IgE и в процессе дегрануляции выделяют токсин, названный главным основным белком. Он содержится в кристалловидной сердцевине эозинофильной гранулы. Матрикс гранулы содержит другое токсическое вещество — катионный белок эозинофилов. Эозинофилы выделяют также гистаминазу и арильсульфатазу, которые инактивируют продукты выделения тучных клеток — гистамин и фактор анафилаксии, вызывающий замедленную реакцию (ФЗР-А). Таким образом, выделяемые эозинофилами продукты подавляют воспалительную реакцию (миграцию гранулоцитов в очаг инвазии).

Рис. 2.4.3.1. Происхождение клеток, участвующих в иммунном ответе (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000)

Рис. 2.4.3.2. Клетки, участвующие в иммунном ответе (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000)

Базофилы и тучные клетки. Базофилы встречаются в циркулирующей крови в очень незначительных количествах — до 0,2% от общего числа лейкоцитов, тучные клетки в крови отсутствуют. Различают тучные клетки слизистых оболочек и соединительной ткани. Гранулы базофилов и тучных клеток содержат гепарин, гистамин, ФЗР-А и ФХЭ-А. Аллерген (антиген, ставший причиной аллергической реакции) служит стимулом дегрануляции базофилов и тучных клеток. В результате дегрануляции происходит мгновенное высвобождение всего содержимого гранул из клетки. Секретируемые медиаторы (гистамин и др.) вызывают патологическое проявление аллергии, но, с другой стороны играют важную роль в антипаразитарном иммунитете, усиливая воспалительную реакцию.

Тромбоциты (кровяные пластинки) — образуются из косномозговых мегакариоцитов, кроме свертывания крови участвуют в иммунном ответе — в воспалительных реакциях. Они экспрессируют белки МНС класса 1, рецепторы для IgG (СD₃₂ и др.) и низкоаффинные рецепторы для IgE (СD₂₃ и др.). Мегакариоциты и тромбоциты несут рецепторы для фактора УШ свертывания крови и комплексы GpIIb/IIIa (CD₄₁) и GpIb/GpIх (CD₄₂). Первый — цитоадгезин, ответственный для связывания с фибриногеном, фибронектином и витронектином. Оба эти комплекса — рецепторы для фактора Виллебранда. Имеется дополнительный рецептор к витронектину — CD₅₁. И рецепторы и комплексы важны для активации тромбоцитов. При повреждении сосудов они прилипают к субэпителиальной поверхности сосудистой стенки, из тромбоцитарных гранул высвобождается их содержимое, в том числе серотонин, фибриноген, что приводит к повышению проницаемости капилляров, активации комплемента и привлечению лейкоцитов.

Цитокины — группа соединений, участвующих в межклеточной передаче сигналов в ходе иммунного ответа. Все цитокины — белки или пептиды, некоторые из них представляют собой гликопротеины. Цитокины подразделяются на несколько групп. К ним относятся интерфероны, интерлейкины, лимфокины и др. Цитокины служат для межклеточной сигнализации при развитии воспалительного процесса.

Интерфероны (ИФ) — цитокины, которые важны в сдерживании некоторых вирусных инфекций. Одну группу интерферонов (ИФα и ИФβ) синтезируют клетки, инфицированные вирусами; другую (ИФγ) — выделяют некоторые активированные Т-лимфоциты. Интерфероны передают противовирусную устойчивость незараженным тканевым клеткам. Они образуются на ранней стадии инфекции и создают первую линию защиты против большинства вирусов.

Интерлейкины (ИЛ) — большая группа цитокинов (от ИЛ-1 до ИЛ-17), синтезируемых Т-лимфоцитами, и очень редко мононуклеарными фагоцитами и другими тканевыми клетками. Обладают разнообразными функциями, в основном стимулируют другие клетки для деления и дифференцировки. Каждый ИЛ действует на определенную группу клеток, экспрессирующих специфичные для данного ИЛ рецепторы.

Дендритные (ветвистые) клетки — антигенпрезентирующие клетки (АПК). Это гетерогенная популяция лейкоцитов с выраженной иммуностимулирующей активностью. Они локализованы в коже, лимфатических узлах, селезенке, эпителиальном и субэпителиальном слоях большинства слизистых оболочек и в тимусе.

Клетки Лангерганса из кожи и других плоскоэпителиальных покровов — по афферентным лимфатическим сосудам мигрируют в паракортикальные области регионарных лимфоузлов, обеспечивая доставку антигенов. На них обильно экспрессированы белки МНС II класса, необходимые для презентации антигена хелперным Т-лимфоцитам.

ФДК — фолликулярные дендритные клетки — презентируют антигены В-лимфоцитам. Содержатся в первичных и вторичных фолликулах лимфоузлов, селезенки и лимфоидной ткани слизистых оболочек. Они не мигрируют из мест своего расположения. Не экспрессируют белки МНС II класса, но связывают антигены посредством рецепторов к компонентам комплемента (CD21 и CD35). Кроме того ФДК экспрессируют рецепторы для Fc.

В центрах размножения внутри вторичных В-клеточных фолликулов обнаружен другой вид АПК — дендритные клетки центров размножения, которые в отличие от ФДК экспрессируют белки МНС II класса и способны к миграции. В центре размножения они взаимодействуют с Т-клетками.

АПК присутствуют в тимусе. Особенно велико их содержание в мозговом веществе органа. В тимусе, где происходит дозревание Т-лимфоцитов, ИДК, по-видимому, ответственны за устранение Т-клеток, реагирующих на собственные антигены организма. Данный процесс называется отрицательной селекцией.

Большинство АПК образуется в костном мозге, хотя их гемопоэтический предшественник остается неизвесным.

Для изучения состава иммунокомпетентных клеток крови и их функциональных свойств необходимо отделить мононуклеары (моноциты, лимфоциты) и гранулоциты от других клеточных элементов цельной крови.

Для этого используется градиент плотности, который позволяет разделить клетки по их весу.

Для идентификации клеток лимфоцитарного ряда, наряду с другими, используется метод розеткообразования, который позволяет определить количественное содержание Т- и В-лимфоцитов

Для фракционирования клеток применяют разнообразные методы, основанные на различиях их физико-химических характеристик (чувствительность к осмотическим и иным воздействиям, удельный вес) и биологическим свойствам (способность к адгезии, чувствительность к влиянию разных биологических реагентов и др.).

Одним из наиболее часто применяемых в иммунологии физико-химических методов фракционирования клеток является дифференциальное центрифугирование в градиенте плотности. Для фракционирования таким образом клеток крови на предварительном этапе производят определение в соответствующей пробе крови количества лимфоцитов общепринятыми в гематологии методами: исчисляют общее содержание лейкоцитов путем подсчета в камере Горяева, затем в мазке из крови в окраске по Романовскому-Гимза определяют процентное содержание лимфоцитов (и других форменных элементов крови). Зная процент лимфоцитов и общее число лейкоцитов, подсчитывают абсолютное содержание лимфоцитов.

Фракционирование иммуноцитов

Пробу крови, разведенную раствором Хенкса или средой 199 в соотношении 1:3–1:4, осторожно наслаивают на 3 мл градиента плотности (смесь фиколла и верографина или урографина) 1,077 в центрифужной пробирке. Пробу центрифугируют 30 мин при 1500 об./мин. Мононуклеары, как самые легкие клетки, оседают на градиенте плотности, равной 1,077 г/мл.

С помощью иглы и шприца отсасывают кольцо мононуклеаров, клетки промывают средой 199, центрифугируют 10 мин при 1500 об./мин.

Готовят взвесь клеток в концентрации 2x106 клеток в 1 мл.

Определение количества Т- и В-лимфоцитов методом розеткообразования

Для идентификации популяции лимфоцитов используются мембранные рецепторы Т- и В-клеток, отличающиеся друг от друга. Для количественного определения Т- и В-лимфоцитов крови используются рецепторы-маркеры, выявление которых основано на феномене розеткообразования. При этом вокруг лимфоцита образуется венчик из индикаторных частиц, несущих на своей поверхности молекулы, связывающиеся с искомыми рецепторами на поверхности лимфоцита. Такая «розетка» должна иметь не менее 3-х индикаторных частиц, лежащих вокруг лимфоцита.

В практической иммунологии для подсчета Т-лимфоцитов применяют тест розеткообразования с эритроцитами барана (ЭБ) — Е-розеткообразования (выявление Е-РОК), так как Е-рецепторы являются мембранными маркерами Т-лимфоцитов.

Другими практически важными рецепторами, позволяющими подсчитывать В-лимфоциты, являются рецепторы к эритроцитам мыши и комплементу, для чего в реакции применяют мышиные эритроциты или ЭБ (или другого вида животного), предварительно обработанные специфическими антителами и комплементом в сублитической дозе (выявление ЕАС-РОК).

При постановке тестов розеткообразования среди лимфоцитов выделяют также популяцию 0-клеток, не несущих маркеров зрелых Т- или В-клеток, и при розеткообразовании вокруг таких лимфоцитов нет индикаторных частиц, либо их меньше 3. Полагают, что это молодые малодифференцированные клетки, которые в дальнейшем могут приобрести признаки Т- или В-клеток. Среди 0-лимофцитов есть разные популяции, которые, хотя и не несут на своей поверхности маркеров Т- или В-клеток, но имеют важное значение в противоопухолевой и противовирусной зашите, уничтожая клетку-мишень с помощью разных цитотоксических механизмов. Это естественные киллеры (ЕК-клетки), которые определяют цитотоксическое действие на клетку мишень уже при первой встрече, без участия каких-либо специфических молекулярных продуктов иммунной системы. Такой механизм влияния ЕК-клеток называется клеточной цитотоксичностью. Это также и киллеры (К-клетки), которые не имеют, как и все 0-клетки, маркеров Т- и В-лимфоцитов, но оказывают цитотоксическое действие на клетку-мишень (опухолевую или зараженную вирусом) в том случае, если на ней адсорбированы молекулярные продукты (антитела), вырабатываемые плазматическими клетками. Такой механизм действия К-клеток на мишень называется антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ).

Зная число Т-, В-лимфоцитов в процентах, можно определить процент 0-клеток:

% 0 — клеток = 100 – (%Т + %В)

Оценивая содержание лимфоцитов, следует анализировать не только относительное, но и обязательно их абсолютное количество, так как при лейкопении или лейкоцитозе одно и то же процентное содержание субпопуляций лимфоцитов будет соответствовать разному числу клеток в единице объема крови.

Приготовление эритроцитов барана и мыши

Эритроциты фильтруют через марлевый фильтр и отмывают 3 раза фосфатно-буферным раствором (РВS). После первого отмывания слой лейкоцитов над эритроцитами убирают. Готовят 2–3% взвесь эритроцитов на РВS (0,06 мл эритроцитов на 2 мл РВS). Для консервирования эритроцитов готовят раствор Олсвера (табл. 2.4.3.1).

Определение количества Т-активных РОК: к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл 1–3% взвеси эритроцитов барана. Инкубируют 5 мин при комнатной температуре, центрифугируют 5 мин при 1000 об./мин, розетки подсчитывают в камере Горяева.

Определение количества Т-лимфоцитов: к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл 3% взвеси ЭБ. Инкубируют 5 мин при 37 °C, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин, инкубируют 60 мин при 12 °С.

Определение количества В-лимфоцитов: к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл 3% эритроцитов мыши и 0,1, мл эмбриональной телячьей сыворотки. Инкубируют 10 мин при 37 °C.

Таблица 2.4.3.1

Приготовление раствора Олсвера для консервации ЭБ

Глюкоза | 20,5 г | 10,25 | 5,13 | 2,56
Цитрат Na | 8,0 г | 4,0 | 2,0 | 1,0
Лимонн. к-та | 0,552 г | 0,276 | 0,138 | 0,069
NaCl | 4,2 г | 2,1 | 1,05 | 0,53
Дист. вода | до 1 л | до 500 мл | до 250 мл | до 125 мл

После инкубации взвесь клеток центрифугируют 3–5 мин при 1000 об./мин, оставляют в холодильнике до утра. Подсчет розеток проводят в камере Горяева. Перед подсчетом в каждую пробирку добавляют по 0,1–0,15 мл РВS и взвесь ресуспендируют.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Определить в пробе крови количество лимфоцитов, общее содержание лейкоцитов и установить абсолютное содержание лимфоцитов.

Задание 2. В градиенте плотности фиколл-верографин (урографин) — 1,077 г/мл получить клетки — мононуклеары и подготовить взвесь клеток в концентрации 2 × 10⁶ клеток в 1 мл.

Задание 3. Провести подсчет В-лимфоцитов в камере Горяева по заранее подготовленным накануне реакциям. Определить в них процент 0-клеток.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. На каких свойствах клеток основано их фракционирование?

2. Что представляет собой дифференциальное центрифугирование иммуноцитов в градиенте плотности и какие проводят предварительные исследования для его правильного проведения?

3. Какие реактивы используют для проведения фракционирования иммуноцитов в градиенте плотности?

4. Чем отличаются мембранные рецепторы Т- и В-лимфоцитов?

5. Как осуществляется подготовка и проведение реакции розеткообразования на Т- и В-лимфоциты?

6. Что представляют собой популяция 0-клеток?

7. Какова особенность цитотоксического действия клеток — естественных киллеров (ЕК)?

8. Как осуществляется приготовление эритроцитов барана и мыши для постановки реакции розеткообразования?

9. Как проводится определение количества Т-активных РОК, Т- и В-лимфоцитов?

10. Какие клетки являются антигенпрезентирующими (АПК)?

11. Что такое интерлейкины, какова их функция?

12. Что такое интерферон, какую функцию выполняет в организме?

Глава 2.5. Методы исследования клеточных факторов неспецифической резистентности организма. Определение фагоцитарной активности клеток крови. Определение метаболической активности фагоцитирующих клеток. НСТ-тест

2.5.1. Цель занятия

Приобрести теоретические знания и практические навыки для определения фагоцитарной и метаболической активности клеток крови.

2.5.2. Материалы и оборудование

Реактивы для постановки НСТ-теста:

1. Раствор нитросинего тетразолия — 2 мг НСТ + 1 каплю 96° этанола + 1 мл среды 199 перемешивают и инкубируют в термостате при 37 °C в течение 30 мин, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин

Надосадочную жидкость разливают в стерильные ампулы и хранят в морозильнике.

2. Взвесь частиц латекса (готовят как для фагоцитоза).

3. Водный 2% раствор метилового зеленого. Предварительно краску очищают хлороформом (5 г краски в 100 мл хлороформа встряхивают и отстаивают до исчезновения фиолетовой окраски).

Для достижения лучших результатов краску можно приготовить на ацетатном буфере рН 5,0, полученном при смешивании 29,5 мл раствора А и 70,7 мл раствора В.

Раствор А: 3 мл ледяной уксусной кислоты доводят.до 100 мл дистиллированной водой; Раствор В: 6,8 г ацетата натрия + 100 мл дистиллированной воды.

Реактивы для постановки НСТ — теста спектрофотометрическим методом:

1. РВS-забуференный физраствор рН 7,2–7,4.

2. Раствор НСТ (10 мг НСТ + 10 мл РВS, перемешивают 30 мин, центрифугируют, хранят при +4 °C в темной посуде не более 2 недель).

3. Суспензия опсонизированного зимозана. 20 мг зимозана + 1 мл сыворотки крови, инкубируют 30 мин при +37 °C при непрерывном помешивании, центрифугируют. Осевший зимозан отмывают 3 раза в 10 мл РВS, затем к осадку добавляют 1 мл РВS, разливают по 0,5 мл в пластиковые пробирки и хранят при –70 °C (размораживают однократно).

4. ДМСО (диметилсульфоксид, димексид).

Реактивы для определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках спектрофотометрическим методом:

1. РВS рН 7,2–7,4.

2. Ортофенилендиамин (ОФД) — 4 мг на 100 мл субстратной смеси.

3. Фосфатно-цитратный буфер (рН 5,0), готовится заранее и хранится при +4 °С. Для его приготовления 25,7 мл 0,2 М раствора фосфата натрия смешивают с 24,3 мл 0,1 М лимонкой кислоты и 50 мл дистиллированной воды, рН доводят до 5,0 0,1 М раствором лимонной кислоты.

4. Раствор перекиси водорода. Перед использованием 1 таблетку гидроперита разводят в 10 мл дистиллированной воды. Добавляют в субстратную смесь из расчета 100 мкл перекиси водорода на 10 мл смеси.

5. 10% серная кислота для остановки реакции.

6. Суспензия опсонизированного зимозана — готовится как для постановки НСТ-теста спектрофотометрическим методом.

2.5.3. Теория вопроса

Методы оценки функционального состояния фагоцитов (моноциты, макрофаги, нейтрофилы) позволяют охарактеризовать состояние неспецифических клеточных факторов защиты.

Фагоцитоз является важнейшим неспецифическим фактором защиты, осуществляющим адгезию, поглощение, переваривание и гидролиз генетически чужеродных для организма клеток. Завершенный фагоцитоз заканчивается полным гидролизом, при незавершенном фагоцитозе не полностью разрушенный антиген способен в дальнейшем формировать полноценную специфическую иммунную реакцию. Снижение фагоцитарной активности клеток крови способствует длительной персистенции чужеродных антигенов в организме и как следствие — развитию длительных вялотекущих воспалительных процессов. Фагоцитоз играет важную роль в формировании противомикробного, противоопухолевого, трансплантационного иммунитета и иммунологической толерантности. В основе оценки фагоцитарной активности лежит способность клеток к связыванию на своей поверхности, поглощению и внутриклеточному перевариванию чужеродных веществ, в том числе частиц латекса (рис. 2.5.3.1).

Повышение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов свидетельствует об активации неспецифического звена иммунитета, при патологиях соответствует острой фазе заболевания. Снижение значений показателей свидетельствует о затормаживаними иммунной активности организма, такое состояние регистрируется в период реконвалесценции. Низкие значения фагоцитарной реакции характерны для хронических, длительно и вялотекущих воспалительных заболеваний в организме животных, вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных состояний.

Оценка метаболической активности нейтрофилов и моноцитов по цитохимическим показателям необходима для выявления уровня их основного механизма киллинга микроорганизмов — кислородзависимого метаболизма.

В основе метода оценки метаболической активности фагоцитирующих клеток в НСТ-тесте лежит их способность в процессе фагоцитоза (или спонтанно) генерировать активные формы кислорода, способные изменять цвет частиц нитросинего тетразолия из желтого в фиолетовый. Снижение метаболической активности клеток крови способствует длительной персистенции чужеродных антигенов в организме и, как следствие, развитию длительных вялотекущих воспалительных процессов. Повышение метаболической активности фагоцитов соответствует острой фазе заболевания. Снижение показателей происходит в период реконва-лесценции. Низкие показатели характерны при хронически длительно и вялотекущих воспалительных заболеваниями, вторичных иммунодефицитах, аутоиммунных состояниях.

Фагоцитоз латекса

Приготовление суспензии частиц латекса. Взвесь латекса 3 раза отмывают физиологическим раствором (10 мин, 3000 об/мин). Осадок ресуспендируют вереде 199 или РВ5 (рН 7,2–7,4). Доводят до конечной концентрации 100–250 × 10⁵ частиц/л, т. е. 8–20 частиц в 4 больших квадратах камеры Горяева.

Схема фагоцитоза, фагоциты и фагоцитоз показаны на рис. 2.5.3.1.

Постановка реакции:

1. К 0,02 мл взвеси лейкоцитов, полученной из крови, добавляют 0,02 мл взвеси частиц латекса. Инкубируют 30 мин в термостате при 37 °C, через каждые 10 мин встряхивая. Затем охлаждают в холодильнике 5 мин, центрифугируют 10–15 мин при 1500 об./мин.

2. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют, делают мазки. Фиксируют в этаноле 3 мин, красят по Романовскому–Гимзе 30 мин

Результат учитывают под иммерсионной системой микроскопа, подсчитывая количество активно фагоцитирующих клеток на 100 нейтрофилов.

а)

Рис. 2.5.3.1. а — схема фагоцитоза; б — нейтрофилы; в — фагоцитоз

Определяют фагоцитарный индекс Гамбургера — процент активных фагоцитов от общего числа сосчитанных нейтрофилов (норме от 40 до 80%); фагоцитарное число Райта (в норме 4–9 ед.).

Постановка реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест):

1 лунка (спонтанный НСТ-тест):

20 мкл взвеси лейкоцитов + 20 мкл НСТ.

2 лунка (стимулированный НСТ-тест):

20 мкл взвеси лейкоцитов + 20 мкл латекса + 20 мкл НСТ.

Инкубируют в течение 30 мин при 37 °C, перемешивая через каждые 10 мин Готовят мазки, фиксируют их 5 мин 96° этанолом, окрашивают метиловым зеленым в течение 20 мин Учет результатов проводят под иммерсионной системой микроскопа, определяя процент положительно прореагировавших клеток на 100 нейтрофилов (как в спонтанном, так и в стимулированном тесте).

Норма: НСТ спонт. — 10–15%, НСТ стим. — 20–50%.

Для оценки интенсивности реакции определяют индекс активации нейтрофилов по формуле:

ИАН = (АхО + Вх1 + Сх2 + ДхЗ) · 100,

где: АхО (–) — выявляются пылевидные гранулы формазана в клетках или их нет вовсе (нулевая активность),

Вх1 (+) — гранулы в виде зерен, занимают менее 1/3 объема ядра,

Сх2 (++) — зерна занимают более 1/3 объема ядра,

ДхЗ (+++) — зерна занимают площадь, превышающую объем ядра.

Норма: индекс активации спонт. = 0,1–0,15,

индекс активации стимул. = 0,5–1,5.

Постановка реакции НСТ-теста спектрофотометрическим методом:

1. 0,5 мл клеточной суспензии (плазмы) вносят в центрифужные пробирки.

2. В лунки планшета № 1 добавляют 50 мкл клеточной взвеси из пробирки и 50 мкл уксусной кислоты и подсчитывают в камере Горяева количество нейтрофилов в 1 большом квадрате. Доводят концентрацию нейтрофилов до 2 × 10/л (с учетом процента лимфоцитов).

3. В 1 и 2 лунки планшета № 2 добавляют клеточную взвесь в нужной концентрации по 100 мкл, отмывают 2 раза РВS (с центрифугированием планшета), добавляют по 100 мкл раствора НСТ.

4. В 1 лунку добавляют 50 мкл РВS (спонтанный тест), во 2 лунку — 50 мкл суспензии опсонизированного зимозана (индуцированный тест). Перемешивают и инкубируют 30 мин при +37 °C.

5. 1 и 2 лунки отмывают 3 раза РВS (с центрифугированием планшета), высушивают планшет 15 мин при +37 °C.

6. В 1 и 2 лунки добавляют по 100 мкл ДМСО, предварительно нагретого до +80 °C, перемешивают. Через 2–3 мин планшет центрифугируют, отбирают 80 мкл надосадочной жидкости в отдельный плоскодонный планшет и фотометрируют при 540 нм (бланк — 80 мкл ДМСО в отдельной лунке).

7. Проводят расчет по формуле:

Постановка реакции определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках спектрофотометрическим методом:

1. Вносят по 1мл исследуемой суспензии клеток в центрифужные пробирки.

2. В лунки планшета № 1 добавляют 50 мкл клеточной взвеси из пробирки и 50 мкл уксусной кислоты и подсчитывают в камере Горяева количество нейтрофилов в 1 большом квадрате. Подводят концентрацию до 2 × 10⁹/л.

3. В 1 и 2 лунки планшета № 2 добавляют клеточную взвесь по 100 мкл, отмывают 2 раза РBS (с перемешиванием и центрифугированием планшета).

4. В 1 лунку добавляют 130 мкл РВS (спонтанный тест), во 2–30 мкл суспензии опсонизированного зимозана и 100 мкл РВS (индуцированный тест). Инкубируют 30 мин при +37 °C, отмывают 3 раза РВS центрифугированием, добавляют по 100 мкл субстратной смеси.

5. Инкубируют в течение 10 мин в темном месте, останавливают реакцию добавлением 50 мкл 10% серной кислоты, центрифугируют планшет для осаждения клеток.

6. Отбирают по 150 мкл надосадочной жидкости в плоскодонный планшет, фотометрируют при 492 нм (бланк — 150 мкл субстратной смеси).

7. Проводят расчет по формуле:

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Поставить реакцию фагоцитоза частиц латекса

Задание 2. Поставить реакцию на тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие реактивы необходимы для постановки реакции фагоцитоза латекса и для постановки НСТ-теста спектрофотометрическим методом?

2. Какие реактивы необходимы для определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках спектрофотометрическим методом?

3. Что лежит в основе фагоцитарной активности клеток? Дайте характеристику завершенному и незавершенному фагоцитозу. О чем свидетельствует снижение и повышение фагоцитарной активности лейкоцитов крови?

4. Что лежит в основе оценки метаболической активности фагоцитирующих клеток в НСТ-тесте? О чем свидетельствует снижение и повышение метаболической активности фагоцитов?

5. Как осуществляется постановка реакции фагоцитоза с латексом?

6. Какие существуют методы постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия?

7. Как осуществляется постановка реакции определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках спектрофотометрическим методом?

Глава 2.6. Методы исследования неспецифических гуморальных факторов защиты (лизоцима, активности комплемента, С-реактивного белка)

2.6.1. Цель занятия

Ознакомиться с неспецифическими гуморальными факторами иммунитета, механизмами реализации их защитного действия и методами определения их активности. Уметь оценивать функционально-метаболическую активность гуморальных факторов иммунитета.

2.6.2. Материалы и оборудование

1. Реактивы для определения лизоцима:

а) агар Дифко;

б) стандарный и ацетоновый порошок биомассы Micrococcus 1узоdeicticus

2. Реактивы для определения комплемента по 50%-ному гемолизу:

а) гемолитическая сыворотка;

б) 3% взвесь эритроцитов барана (эритроциты отмывают 2–3 раза физиологическим раствором, путем центрифугировании, из осадка готовят 3% взвесь);

в) исследуемая сыворотка.

3. Реактивы для определения СРВ

а) стандартная сыворотка

2.6.3. Теория вопроса

Знания неспецифических факторов иммунитета необходимы для оценки состояния естественной резистентности организма и понимания специфических иммунных реакций, протекающих с участием неспецифических факторов.

Лизоцим — гидролитический фермент, содержит 129 аминокислот, образующих единую полипептидную цепь. Обладает растворяющим действием в отношении высокомолекулярных полисахаридов ряда видов бактерий. Содержится в слюне, слезе, носовой слизи, крови, лимфе, молоке, курином белке, икре рыб. Присутствие и активность лизоцима определяют по его способности вызывать лизис бактерии Micrococcus lуsоdeicticus.

Комплемент — система белковых факторов, каскадно активируемых в условиях внедрения в организм чужеродных агентов. Различают альтернативный и классические пути активации комплемента. Первый состоит в стабилизации и амплификации спонтанного гидролиза С3 компонента комплемента, второй — в серии реакций, запускаемых в результате связывания с фиксированными на мембране иммунными комплексами факторов группы С1. Оба пути приводят к образованию С3/С5-конвертаз и реализации общего заключительного этапа, состоящего в формировании комплекса С5–9, который атакует мембрану. Результатом активации комплемента является опсонизация или лизис клеток-мишеней и формирование активных низкомолекулярных фрагментов факторов комплемента.

Повышение комплементарной активности сыворотки крови свидетельствует об активации неспецифической резистентности организма и отмечается в острый период заболевания при адекватном иммунном ответе, а также в поздние сроки заболевания при наличии признаков аутоиммунизации. Сниженные показатели свидетельствуют о недостаточности синтеза белков комплемента, либо об активном его расходовании. Такое состояние является показателем вторичных иммунодефицитов в организма животных. Чрезмерная активация системы комплемента иммуностимуляторами может способствовать накоплению большого количества его компонентов СЗа и С5а, которые являются анафилатоксинами и могут способствовать развитию анафилактического шока.

Появление СРБ в сыворотке крови свидетельствует о наличии острофазового ответа в организме. СРБ относится к белкам острой фазы. Его синтез в гепатоцитах активизируется под влиянием I L-1. СРБ способствует опсонизации микроорганизмов, обеспечивая активацию системы комплемента.

Постановка реакции определения лизоцима

Готовят 1%-й агаровый гель (Дифко) на 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). В расплавленный агар температурой 60–70 °C вносят ацетоновый порошок биомассы Micrococcus 1уsоdeicticus из расчета 10 мг на 100 мл геля. Компоненты перемешивают и разливают в чашки Петри (толщина слоя 4 мм). В застывшем агаре делают лунки диаметром 5 мм.

Параллельно определяют активность стандартного лизоцима, кристаллизованного из яичного белка. Для этого лизоцим разводят в 1/15 М ФСБР, чтобы получить разведения с концентрацией 0,5; 1; 3; 5, 10; 20; 40 и 70 мг/мл. По 0,05 мл каждого разведения лизоцима вносят в лунки. Чашки Петри выдерживают 48 ч во влажной камере при 37 °C и измеряют диаметр зоны лизиса Micrococcus 1уsоdeicticus вокруг лунок. По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая на осях координат значения концентрации лизоцима и диаметра зоны лизиса. Сыворотку крови разводят в ФСБР в соотношении 1:5, вносят по 0,03 мл в лунки и далее поступают, как при определении активности стандартного лизоцима. Измерив диаметр зоны лизиса, по калибровочной кривой вычисляют содержание лизоцима в исследуемой пробе.

Постановка реакции определения комплемента по 50% гемолизу

1. Готовят гемолитичесуюя систему: смешивают в равных объемах 3% взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку, инкубируют в термостате 30 мин при 37 °C, каждые 15 мин помешивая.

2. Готовят разведение исследуемой сыворотки: разводят физиологическим раствором в соотношении 1:10 (1,8 мл физ. р. + 0,2 мл сыворотки).

Пробирки инкубируют в термостате при 37 °C 45 мин, затем выдерживают в холодильнике 10 мин, центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. На-досадочную жидкость отделяют в планшет и измеряют оптическую плотность при 570 нм.

Расчет: Вычисляют процент гемолиза в каждой лунке по показаниям экстинкции (Е°). При этом: Ек (контроль) — 100%, Ео (опыт) — Х%.

Строят график зависимости интенсивности гемолиза от титра сыворотки (по оси абсцисс — титр сыворотки, по оси ординат — % гемолиза). По графику находят титр сыворотки, при которой происходит 50% гемолиз, что соответствует 1 ед СН₅₀. Производят пересчет на 1 мл сыворотки крови (А):

А мл — 1 ед. СН₅₀

1 мл — Х ед.

В норме активность комплемента в сыворотке крови составляет 40–80 ед СН₅₀.

Схема постановки реакции представлена в табл. 2.6.3.1.

Таблица 2.6.3.1

Постановка реакции

№ пробирок | № 1 | № 2 | № 3 | № 4 | № 5 | № 6
Исследуемая сыворотка | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,3 | –
Физиологический раствор | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,2 | –
Гемолитическая система | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5
Дистиллированная вода | – | – | – | – | – | 1,5

Постановка реакции определения С-реактивного белка (СРВ)

Ампулу диагностической сыворотки растворяют в 1 мл воды, хранят не более 1 недели в холодильнике. В капилляр набирают на 1/3 длины разведенную диагностическую сыворотку. Капилляр протирают марлевым тампоном, опускают тем же концом в исследуемую сыворотку и набирают ее на 1/3 длины капилляра. Покачивают 10–12 раз. Капилляр устанавливают вертикально в пластилин. Учет проводят через 24 часа инкубации при комнатной температуре по наличию преципитата высотой: 1 мм — + слабо положительный; 2 мм — ++ положительный; З мм — +++ положительный; 4 мм — ++++ резко положительный. Количество преципитата учитывают по всему капилляру.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Провести количественное определение лизоцима в сыворотке крови животного.

Задание 2. Провести количественное определение комплемента в сыворотке крови животного по 50%-ному гемолизу.

Задание 3. Определить С-реактивный белок.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие факторы иммунной защиты относятся к гуморальным?

2. Что представляет собой лизоцим? С каким тест-микробом и какими методами определяют активность лизоцима?

3. Что представляет собой комплемент?

4. Как взаимодействет система комплемента со свертывающей и кининовой системами крови?

5. Как осуществляется определение комплемента по 50% гемолизу?

6. О чем свидетельствует повышение и снижение комплемента в сыворотке крови животного?

7. О чем свидетельствует появление С-реактивного белка? Какова роль С-реактивного белка в организме? Его определение в сыворотке крови?

Глава 2.7. Количественное определение иммуноглобулинов различных классов методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК)

2.7.1. Цель занятия

Приобрести теоретические знания и практические навыки для проведения реакции иммунодиффузии в геле по Манчини и выявления циркулирующих иммунных комплексов.

2.7.2. Материалы и оборудование

1. Реактивы для количественного определение иммуноглобулинов методом РИД в геле (метод Манчини):

а) Приготовление буфера рН 8,56 ±0,04. В 250 мл горячей дистиллированной воды разводят 0,690 г веронала. Раствор охлаждают и добавляют 4,380 г мединала, доводят дистиллированной водой до 500 мл.

б) Приготовление агара (1,5%). К 250 мл приготовленного буфера добавляют 3,750 г агара Дифко. В 150 мл холодного буфера разводят сухой агар и выливают в кипящий буфер. Кипятят 10–15 мин, разливают в стерильные флаконы. Хранят в холодильнике.

2. Реактивы для определения ЦИК спектрофотометрическим методом:

1) 0,1 N боратный буфер, рН = 8,4:

а) 1,24 г борной кислоты разводят в 100 мл дистиллированной воды,

б) 1,9 г буры разводят в 100 мл дистиллированной воды.

Смешивают 55 мл раствора (а) и 45 мл раствора (б), добавляют 100 мл дистиллированной воды.

2) а) 4% раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ, т. т.6000) в дистиллированной воде,

б) 3% раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ, т. т. 6000) в дистиллированной воде.

Растворы ПЭГ готовят в день постановки реакции.

3. Реактивы для определения ЦИК в РИД:

а) 0,1 N боратный буфер, рН = 8,4

(3,410 г борной кислоты и 4,275 г буры разводят в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят до 1 л дистиллированной водой, измеряют рН.)

б) 7% раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ, т.т 6000), рН 7,2. (К 35 г ПЭГ добавляют 500 мл дист. воды. Для лучшего растворения можно поместить на 30–60 мин в термостат 37 °C.)

в) 3,5% раствор ПЭГ на боратном буфере. (К 17,5 г ПЭГ добавляют 500 мл боратного буфера рН 8,4. Хранят в темной посуде при комнат. температуре.)

г) Забуференный физиологический раствор (ЗФР) рН 7,2–7,4. (К 8,2 г натрия хлорида, 1,15 г натрия фосфорнокислого двухзамешенного (Na₂НРО₄), 0,2 г калия фосфорнокислого двузамещенного (К₂НРО₄) добавляют до 1 л дистиллированной воды. Измеряют рН.

Хранят до использования при комнатной температуре.

2.7.3. Теория вопроса

Методы определения иммуноглобулинов различных классов и ЦИК необходимы для оценки эффективности гуморального звена иммунитета.

Иммуноглобулины — эффекторные молекулы, обеспечивающие опсони-зацию, агглютинацию, преципитацию и нейтрализацию различных молекул. Они играют важную роль в обеспечении противоинфекционного иммунитета, способствуют поддержанию гомеостаза и т. д.

IgG — среди всех иммуноглобулинов доминируют в количественном отношении. В сыворотке млекопитающих составляют до 75% от всех Ig. Выполняют антибактериальную защиту через механизм комплементзависимого лизиса микробной клетки, и проникновение через плаценту с той же защитной для развивающегося зародыша функцией, и «армирование» макрофагов (цитофильность к макрофагам), в результате чего они становятся цитотоксическими для трансплантатов и опухолей, и участие в повышенной реакции аллергического типа.

IgА — являются доминирующим иммуноглобулином секретов организма (слюны, пищеварительного сока, выделений слизистой носа и молочной железы). В сыворотке крови его содержание незначительно — около 10–15% от общего количества Ig. Функционально IgА выступает в качестве первой линии защиты на слизистых поверхностях, препятствуя проникновению вирусов в организм. Хотя IgА не связывает комплемент и в силу этого не обладает бактерицидной активностью, он играет важную роль в нейтрализации бактериальных токсинов. Кроме того у млекопитающих, включая и человека, секреторный IgА содержится в молозиве в количестве, достаточном для обеспечения специфического иммунитета новорожденных.

IgМ — из всех иммуноглобулинов наиболее сложно организован и имеет наибольшую молекулярную массу — 950 кДа. Кроме пентамерной, свободной формы IgМ имеется мономерная форма, которая представлена на поверхности В-клеток и выполняет функцию антигенраспознающего рецептора. Отличие мономера, ассоциированного с мембраной, от пентамера состоит в количестве аминокислотных остатков в хвостовой части тяжелой цепи. В процессе гуморального иммунного ответа наиболее ранние антитела относятся к IgМ-классу. Они же первыми появляются в онто- и филогенезе. Наибольшую активность IgМ проявляет в антибактериальном иммунитете и при некоторых аутоиммунных заболеваниях.

IgЕ — его содержание в сыворотке крови крайне мало, хотя удельный вес этих иммуноглобулинов в аллергических реакциях является доминирующим. Он способен взаимодействовать с тучными клетками и базофилами посредством Fc-области и соответствующего рецептора на этих клетках. После связи IgЕ с антигеном (аллергеном) тучные клетки получают сигнал к секреции вазоактивных аминов и других фармакологически значимых соединений, что собственно и приводит к развитию аллергической реакции.

IgД — был открыт как обычный миеломный белок, затем его в очень небольшом количестве обнаружили в сыворотке крови (меньше 1% от всех Ig). Функция не достаточно ясна, общеизвестна его роль в качестве одного из основных (наряду IgМ) типов мембранных иммуноглобулинов.

В тесте Манчини определяются иммуноглобулины трех основных классов: IgG, IgА, Ig М.

Соединение антигена с антителом называется иммунным комплексом. Различают циркулирующие иммунные комплексы (в сыворотке крови) и фиксированные иммунные комплексы (в тканях). Образование ЦИК сопровождает любой иммунный ответ. При нормальном состоянии иммунной системы они фагоцитируются и удаляются из организма, при патологических состояниях (недостаточность фагоцитоза, комплемента и др.) могут откладываться в тканях, сосудистых стенках, органах, вызывая синдром иммуноком-плексной патологии. Существует несколько методов определения ЦИК: преципитация, турбидиметрия, ИФА и др.

Метод преципитации ЦИК с последующим их типированием является наиболее распространенным и простым.

Увеличение Ig класса М характерно для острых процессов, класса G -для стадии специфического иммунного ответа, одновременное повышение уровня иммуноглобулинов класса G и класса М — для вторичного иммунного ответа при обострении (рецидива) хронического процесса. Сниженный уровень иммуноглобулинов свидетельствует о нарушении их синтеза, что характерно для длительно протекающих болезней и ослабленного иммунного статуса животного.

Постановка реакции количественного определения иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле (метод Манчини)

1. Разводят моноспецифические сыворотки добавлением 1 мл дистиллированной воды. Титр сыворотки должен в 2 раза превышать рабочий титр.

2. Мерные пробирки надписывают (А, М, G), вносят в них соответствующие моноспецифические сыворотки, доводят остуженным (57 °C) агаром до 9 мл и заливают пластиковые плашки, надписанные и предварительно обработанные 96º этанолом. После застывания агара в нем пробойником вырезают лунки d = 2 мм, на расстоянии 10–15 мм одна от другой.

3. Разводят исследуемую сыворотку веронал-мединаловым буфером 1:2 (для IgМ и IgА), 1:4 (для IgG).

4. Разведение стандартных сывороток производят в аналогичных соотношениях (1:2, 1:4).

5. В лунки первого ряда для построения калибровочных кривых зависимости концентрации иммуноглобулинов от диаметра колец иммунодиффузии вносят контроли: стандартные сыворотки, разведенные в соотношении 1:4, 1:2 и цельные сыворотки по 2 мкл.

6. После каждой исследуемой сыворотки шприц промывают. После работы шприц промывают сначала дистиллированной водой, затем 96º-ным этанолом.

7. Плашки инкубируют в эксикаторе 24 ч при комнатной температуре для определения IgA, IgG и 48 ч для Ig М.

8. Измеряют диаметры колец преципитациии.

9. Уровень иммуноглобулинов определяют по калибровочной кривой.

Постановка реакции определения циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) спектрофотометрическим методом

Исследуемую сыворотку крови (0,3 мл) разводят 0,9 мл боратного буфера. Используют свежую или консервированную (хранят не более 4 суток) 0,01% раствором азида натрия сыворотку крови. Перемешивают, разливают в 3 пробирки и добавляют:

в 1 (контроль) — 2,7 мл 0,1 М боратного буфера,

во 2 (опыт) — 2,7 мл 4% раствор ПЭГ,

в 3 (опыт) — 2,7 мл 3% раствор ПЭГ.

Содержимое пробирок перемешивают, инкубируют при комнатной температуре 1 час, фотометрируют при длине волны 450 нм в кювете I см. Количественное содержание ЦИК определяют по 4% ПЭГ. Результат умножают на 1000. Ответ выдают в единицах оптической плотности.

Размеры ЦИК определяют с использованием разных концентраций ПЭГ. Низкие концентрации ПЭГ осаждают крупные, с преобладанием антител, высокие — мелкие ЦИК с преимущественным содержанием антигенов. При этом определяют соотношение (коэффициент — К):

К=С₁/С₂,

где: С₁ — оптическая плотность раствора во 2 пробирке (4% ПЭГ);

С₂ — оптическая плотность раствора в 3 пробирке (3% ПЭГ).

При К < 1,1 преобладают крупные, 1,1 < К < 1,5 — средние, К > 1,5 — мелкие ЦИК.

Для выявления ЦИК, содержащих в своем составе определенный класс иммуноглобулинов, проводят качественное определение ЦИК. Для этого к 500 мкл нативной сыворотки добавляют 500 мкл 7% ПЭГ, перемешивают, инкубируют при +4 °C 18–24 ч. На следующие сутки центрифугируют 20 мин при 1500 об./мин, надосадок сливают и добавляют 1 мл 3,5% ПЭГ, ресуспензируют, центрифугируют при 1500 об./мин по 20 мин 2 раза, сливают надосадок, добавляют 0,1 мл (2–3 капли) 0,1N NаОН.

Готовят иммунодиффузионные планшеты для определения IgА, IgМ, по Манчини на агаре. Рассчитывают значения концентрации компонентов ЦИК исследуемых образцов сыворотки по калибровочной кривой.

Для определения Ig Е ставят ИФА, добавляя в лунки планшета вместо сыворотки суспензию ЦИК.

Постановка реакции определения циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в РИД

Анализ ЦИК проводят в 2 этапа: 1 — выделение ЦИК, 2 — типирование ЦИК.

1. Выделение ЦИК. К 50 мкл исследуемой сыворотки добавляют 1,2 мл боратного буфера или 100 мкл сыворотки +2,5 мл боратного буфера (1:25 и 1:50). Добавляют в каждую пробирку с сывороткой 7% раствор ПЭГ в соотношении 1:1 (1,25 или 2,5 мл). Ставят штатив с пробирками в холодильник при +4 °C на 18 ч. После инкубации центрифугируют 30 мин при 3000 об./мин. Надосадок сливают, обнаруженные ЦИК учитывают по 4 бальной системе.

2. Типирование ЦИК. К осадку добавляют 1,5 мл 3,5% ПЭГ, перемешивают, переливают в пробирки типа «эппендорф», центрифугируют 2 раза по 20 мин при 8000 об./мин. После первого центрифугирования надосадок сливают и добавляют 1 мл 3,5% ПЭГ. После второй промывки выливают надосадок, тщательно вытряхивают жидкость из пробирок на фильтровальную бумагу, добавляют по 0,1 мл ЗФР, перемешивают.

Готовят иммунодиффузионные планшеты (IgA, IgM, IgG). Вносят в них по 5–10 мкл контрольного образца (титр разведения указан на флаконе и в инструкции) и по 5–10 мкл исследуемых суспензий ЦИК, инкубируют при комнатной температуре 24 ч. Проводят измерение колец преципитации контрольного образца и исследуемых проб с помощью бинокулярной лупы на трех планшетах (IgA, IgM, IgG). Строят калибровочную кривую зависимости величины диаметра преципитата от концентрации ЦИК на каждую из трех планшет (IgA, IgM, IgG). Рассчитывают значения концентрации компонентов ЦИК исследуемых образцов сыворотки крови по калибровочной кривой. У здоровых животных ЦИК в РИД отрицательный.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Провести определение циркулирующих иммунных комплексов с готовыми для реакции реактивами.

Задание 2. Провести количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии в геле (по Манчини) с готовыми для реакции реактивами.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Какие реактивы используются для количественного определения иммуноглобулинов методом РИД в геле (по Манчини)?

2. Какие реактивы применяются для определения ЦИК спектрофотометрическим методом?

3. Какие реактивы применяются для определения ЦИК в РИД?

4. Каково значение разных классов иммуноглобулинов в организме?

5. Что такое ЦИК, какую роль они выполняют?

6. О чем свидетельствует увеличение или снижение в организме IgA, IgG, IgM?

7. Как проводится определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле по Манчини?

8. Как осуществляется определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) спектрофотометрическим методом?

9. Какова последовательность определения циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в РИД?

Глава 2.8. Методы оценки функциональной активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации (РБТЛ)

2.8.1. Цель занятия

Приобрести теоретические знания и практические навыки проведения реакции бласттрансформации лимфоцитов.

2.8.2. Материалы и оборудование

Ламинарный бокс, автоклав, СО₂ инкубатор, термостат, микроскоп, лампа УФО, сухожаровой шкаф, эксикатор, центрифуга, автоматические дозаторы, насадка для фильтрования — фильтры «Мillipor», стерильные пластиковые наконечники, стерильные планшеты (24 луночные), предметные стекла. Реактивы: среда 199 или Игла, инактивированная сыворотка крупного рогатого скота или другого вида животного, ФГА-Р-митоген, антибиотики (гентамицин), 10%-ная уксусная кислота, фиксатор, азид Na, краска Романовского-Гимза, РВS — забуференный физиологический раствор.

2.8.3. Теория вопроса

РБТЛ — функциональный метод оценки активности клеточного и гуморального звена иммунитета in vitro. Позволяет определить пролиферативную способность лимфоцитов в ответ на стимуляцию митогенами и их специфическую реактивность к чужеродным антигенам, аутоантигенам и аллергенам при использовании их как активаторов пролиферации иммунокомпетентных клеток.

Встреча лимфоцитов с антигеном или митогеном, сопровождается их активацией, заключающейся в бласттрансформации и клонообразовании. РБТЛ без применения стимуляторов (митогенов или аллергенов) позволяет оценить исходное состояние клеток. Для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов в РБТЛ (способности к пролиферативному ответу) в качестве митогена используется фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А (КонА), для В-лимфоцитов — липополисахариды (ЛПС) и митоген лаконоса (РWА).

Норма РБТЛ спонтанной (без стимулятора) составляет 0–3%. Увеличение показателя свидетельствует о повышенной реактивности лимфоцитов (к моменту исследования иммунная система испытывает нагрузки — инфекцию, отторжение трансплантата). Норма РБТЛ, стимулированной митогеном, составляет 50–80%. Снижение — свидетельствует о нарушении процессов бласттрансформации лимфоцитов и, как следствие, о сниженной активности Т-или В-клеточного звена иммунитета (в зависимости от вида митогена). Значения показателя РБТЛ при стимуляции аллергеном или антигеном, должны соответствовать показателям РБТЛ спонтанной. Если этот показатель выше, то он свидетельствует о сенсибилизации организма к данному аллергену или антигену.

Постановка РБТЛ

1) Титрование ФГА (определение рабочей дозы)

Титрование ФГА необходимо проводить при использовании новых реактивов. Схема титрования ФГА представлена в табл. 2.8.3.1.

Таблица 2.8.3.1

Схема титрования ФГА (в планшете)

| Среда 199 | ФГА | Кровь
1 лунка | 1 мл | 0 | 50 мкл
2 лунка | 1 мл | 3 мкл | 50 мкл
3 лунка | 1 мл | 5 мкл | 50 мкл
4 лунка | 1 мл | 10 мкл | 50 мкл
5 лунка | 1 мл | 15 мкл | 50 мкл
6 лунка | 1 мл | 20 мкл | 50 мкл
7 лунка | 1 мл | 25 мкл | 50 мкл
8 лунка | 1 мл | 30 мкл | 50 мкл
9 лунка | 1 мл | 35 мкл | 50 мкл
10 лунка | 1 мл | 40 мкл | 50 мкл
11 лунка | 1 мл | 45 мкл | 50 мкл
12 лунка | 1 мл | 50 мкл | 50 мкл

а) Приготовление 1%-ного раствора ФГА: во флакон с ФГА добавляют 5 мл стерильной дистиллированной воды. Разливают по 0,11 мл в стерильные эппендорфовские пробирки и замораживают (подлежит только однократному размораживанию);

б) Приготовление 0,1%-ного раствора ФГА: в стерильный пенициллиновый флакон переносят 100 мкл 1%-ного ФГА и добавляют 900 мкл стерильного РВS (рН 7,2–7,4);

в) 24-луночный планшет обеззараживают спиртом, облучают. Инкубация проводится в течение 3 дней (72 ч) в СО₂-инкубаторе. Рабочей дозой ФГА считается доза в лунке, где отмечен самый высокий показатель бласттрансформации лимфоцитов. Забор крови для исследования проводится стерильно. В стерильный пенициллиновый флакон с раствором ЭДТА (2,6%) в объеме 0,5 мл добавляют 5 мл крови, перемешивают.

Постановка реакции (проводится в стерильных условиях)

1) Готовят среду для инкубации клеток, содержащую 1ер 0% раствор сыворотки крупного рогатого скота, или другого вида животного (готовят 1 раз в неделю):

45 мл среды 199 + 5 мл сыворотки + 80 мкл гектамицина

2) Постановка реакции в стерильных 24-луночных планшетах:

контроль
опыт

1 мл среды 199
1 мл среды 199

35 мкл среды 199
35 мкл митогена ФГА
(в рабочей дозе)

50 мкл крови
50 мкл крови

Инкубацию проводят в СО₂ инкубаторе в течение 72 часов.

Содержимое лунок собирают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10 минут при 1000 об/ мин Супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в 10 мл уксусной кислоты и центрифугируют 10 мин при 1000 об./мин. К осадку (предварительно ресуспендированному) добавляют каплю фиксатора. Делают мазки на предметном стекле. Высушивают на воздухе. Красят по Романовскому–Гимзе.

В мазках подсчитывают процент бластных клеток на 100–200 сосчитанных лимфоцитов. В контроле бластные клетки отсутствуют (или единичные), в опыте с митогеном число лимфобластов может достигать 50–80%.

Задание для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомление с реакцией бласттрансформации лимфоцитов.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. В чем состоит сущность РБТЛ? Что означает бласттрансформация лимфоцитов?

2. Что используется в качестве митогена для оценки функционального состояния Т- и В-лимфоцитов в РБТЛ?

3. Какие реактивы необходимы для постановки РБТЛ?

4. Какие растворы ФГА для проведения РБТЛ?

5. По какой схеме проводится титрование ФГА в РБТЛ?

6. Какая доза ФГА является рабочей?

7. Как осуществляется забор крови животного для проведения РБТЛ?

8. Как ставится контроль в РБТЛ?

9. Как осуществляется после титрования ФГА постановка самой РБТЛ?

10. О чем свидетельствует повышение показателя бласттрансформации лимфоцитов?

11. О чем свидетельствует снижение показателя бласттрансформации лимфоцитов?

12. Каково значение РБТЛ, его применение в ветеринарии?

Глава 2.9. Оценка функциональной активности торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ)

2.9.1. Цель занятия

Приобрести теоретические знания и практические навыки для проведения РТМЛ.

2.9.2. Материалы и оборудование

Ламинированный бокс, автоклав, термостат, СО₂ инкубатор, лампа УФО, сухожаровой шкаф, центрифуга, эксикатор, автоматические дозаторы, насадки для фильтрования — фильтры «Milipor», стерильные пластиковые наконечники, система «Мигроскрин». Реактивы: среда 199 или Игла, инактивированная сыворотка крупного рогатого скота или другого вида животного, ФГА-Р-митоген, антибиотики, L-глутамин, буфер «Hepes».

Реакция торможения миграции лейкоцитов используется для выявления способности лейкоцитов к секреции факторов торможения (МИФ) или стимуляции миграции (МСФ) лейкоцитов после контакта с антигеном или митогеном.

Тест торможения миграции лейкоцитов основан на способности активированных Т-лимфоцитов выделять макрофаг-ингибирующий фактор (МИФ), способствующий задержке фагоцитов в очаге воспаления и играющий важную роль в антибактериальной и противоопухолевой защите.

При наличии сенсибилизации к аллергенам или аутоантигенам он способствует развитию аллергического или аутоиммунного воспаления.

Другой фактор — макрофаг-стимулирующий (МСФ) — усиливает миграцию фагоцитов в очаг воспаления и участвует в развитии иммуносупрессии. В организме существует баланс между МИФ и МСФ. Длительное отклонение в ту или иную сторону отражает период развития патологии.

У здоровых животных или при хронических воспалительных процессах значения показателя ИМ колеблются в пределах 0,85–1,15%. Значения ИМ менее 0,85% — соответствуют фазе обострения воспалительного процесса (если в качестве стимулятора использовался митоген) или о наличии сенсибилизации организма к аллергену при использовании в процессе инкубации подозреваемого аллергена.

Значения ИМ более 1,15% соответствуют фазе реконвалесценции при адекватном иммунном ответе, либо отражают действие факторов иммуносу-прессии (при хроническом воспалении).

Наличие факторов иммуносупрессии при использовании в качестве стимуляторов какого-либо аллергена свидетельствует о развитии толерантности к исследуемому аллергену.

Приготовление компонентов культуральной среды

1) Антибиотики:

а) растворяют 3 флакона пенициллина по 1 млн в 15 мл дистиллированной воды;

б) растворяют 5 г стрептомицина в 15 мл дистиллированной воды;

в) смешивают растворы антибиотиков и хранят в морозильнике (в пробирках по 0,15мл).

2) Буфер «Нереs»:

а) растворяют 2,38 г сухого порошка в 10 мл среды 199;

б) пропускают через стерилизующую насадку в стерильный флакон. Хранят в морозильнике (по 0,5 мл раствора в 1 пробирке).

3) L-глутамин:

а) растворяют 150 мг сухого порошка в 500 мл среды 199;

б) пропускают через стерилизующую насадку в стерильный флакон. Хранят в морозильнике до использования (по 100 мл раствора в I флаконе).

Культуральнная среда (готовить в стерильном боксе): к 100 мл среды 199 или среды Игла добавляют стерильно: 1 мл L-глутамина, 0,5 мл буфера «Нереs» и 0,07 мл раствора антибиотиков. Хранят в холодильнике при +4 С°.

Приготовление разведений фитогемагглютинина (ФГА):

1) Готовят маточный раствор ФГА: стерильно добавляют во флакон с ФГА (5 мг) 5 мл культуральной среды. Хранят в морозильнике по 0,15 мл в 1 пробирке.

2) Перед использованием берут 5 центрифужных пробирок и вносят:

в 1 пробирку (контроль) — культуральную среду,

во II пробирку — к 5 мл культуральной среды добавляют 0,1 мл маточного раствора ФГА (20 мкг/мл ФГА),

в III пробирку — в 2 мл культуральной среды переносят 2 мл раствора из II пробирки (10 мкг/мл ФГА),

в IV пробирку — в 1 мл культуральной среды переносят 1 мл раствора из III пробирки (5 мкг/мл ФГА),

в V пробирку — в 4 мл культуральной среды переносят 1 мл раствора из IV пробирки (1 мкг/мл ФГА).

2.9.3. Постановка реакции

1. Венозную кровь в количестве 2–3 мл помещают в пробирку с гепарином (5–7 ед/мл), перемешивают, отстаивают 30–40 мин при 37 °C для получения плазмы.

2. 0,5–0,7 мл плазмы центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают. Осадок отмывают 1 раз при центрифугировании с культуральной средой (10 мин при 1500 об/мин).

4. Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют в 0,5–1,0 мл среды, получая клеточную суспензию с концентрацией клеток 10–30 × 10⁶/мл.

5. 96-луночный плоскодонный планшет заполняют таким образом (4 угловые лунки планшета оставляют пустыми)

По вертикали:

4 лунки — по 100 мкл культуральной среды (4 контроля)

1 лунка — 100 мкл раствора из II пробирки

1 лунка — 100 мкл раствора из III пробирки

1 лунка — 100 мкл раствора из IV пробирки

1 лунка — 100 мкл раствора из V пробирки

На 1 исследуемое животное приходится 1 ряд лунок по вертикали.

6. Клеточную суспензию набирают автоматической пипеткой по 5 мкл. Наконечник однократно опускают в среду 199 (ополаскивают от избытка клеточной суспензии).

7. Собирают систему «Мигроскрин». Наконечники вставляют в гнезда штатива.

8. Инкубируют при 18–20 °C 1 час на строго горизонтальной поверхности.

9. Штатив с наконечниками осторожно снимают с планшета.

10. Планшет в строго горизонтальном положении помещают в СО₂-инкубатор при 37 °C на 18–20 часов.

Учет результатов — на инвертированном микроскопе измеряют диаметр кольца миграции клеток.

Рассчитывают индекс миграции (ИМ):

(ИМ) = D²опыт / D²контроль,

где: D опыт — средний диаметр для 4 параллельных опытных микрокультур (с ФГА),

D контроль — средний диаметр для 4 параллельных контрольных микрокультур.

Значения ИМ менее 0,85 свидетельствуют о выработке лимфоцитами факторов торможения миграции лейкоцитов, значения ИМ более 1,15 — о продукции факторов активации миграции лейкоцитов.

Для расчета показателя в процентах от контроля применяют формулу:

ИМ = (D² опыт / D² контроль –1) × 100.

Знак (+) указывает на степень усиления миграции, знак (–) — на степень подавления миграции.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с постановкой реакции торможения миграции лейкоцитов.

Задание 2. Ознакомиться с определением содержания цитокинов в биологических средах методом ИФА.

Вопросы для самоконтроля знаний

1. На чем основан тест торможения миграции лейкоцитов?

2. Какова роль макрофаг — стимулирующего фактора (МСФ) в иммунном ответе?

3. Что представляет собой макрофаг — ингибирующий фактор (МИФ)?

4. Как осуществляется подготовка компонентов культуральной среды для постановки РТМЛ?

5. Как готовится культуральная среда для постановки РТМЛ?

6. Как осуществляется разведение фитогемагглютинина (ФГА) для постановки РТМЛ?

7. Как проводится постановка РТМЛ?

8. Каково значение РТМЛ?

Глава 2.10. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.10.1. Цель занятия

Приобрести теоретические знания и практические навыки для проведения ПЦР.

2.10.2. Теория вопроса

Сущность метода ПЦР. Применение, преимущества и характерные черты диагностики на основе ПЦР

В основе метода лежит способность генетического материала (молекул ДНК) к самовоспроизведению. ПЦР — это ферментативный синтез in vitro специфического фрагмента ДНК, приводящий к увеличению числа копий этого фрагмента в миллионы раз. Длина ПЦР-фрагмента может достигать 20–40 тысяч пар нуклеотидов (это все равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

Метод позволяет определять сверхмалые количества нуклеиновых кислот ДНК или РНК. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце

На практике метод ПЦР позволяет детектировать ДНК и РНК, выделенные из различных биологических образцов (кровь, моча, мокрота, смывы, соскобы, биопсийный материал), а также из проб окружающей среды. Время обнаружения некоторых возбудителей методом ПЦР, по сравнению с микробиологическим исследованием, может сокращаться в 10–20 раз.

ПЦР применяется в ветеринарии и медицине для диагностики инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, наследственных заболеваний (генных дефектов), онкологических заболеваний, дифференциальной диагностики, для получения рекомбинантных вакцин, контроля эффективности генотерапии, в работе с трансгенными животными, в трансплантологии (для обследования доноров — органов на инфицированность микроорганизмамии, контроля безопасности донорской крови, ее компонентов, препаратов плазмы).

Преимущества и характерные черты диагностики на основе ПЦР:

— Чувствительность (достигает 10–15 г, что составляет несколько копий патогена на пробу объемом 0,2 мл. Благодаря высокой чувствительности, метод ПЦР позволяет определять возбудителя заболевания на ранних стадиях, когда выявление инфекционного агента другими методами невозможно.

— Специфичность (обеспечивается подбором специфических компонентов реакции и условий ее проведения.

— Тест система разрабатывается таким образом, чтобы определять строго определенный инфекционный агент, или группу инфекционных агентов, вызывающих данное заболевание).

— Возможность дифференциальной видовой диагностики (такая диагностика требуется тогда, когда известно несколько видов возбудителя, при этом различные виды варьируют по своей патогенности. Например, известно более 70 видов микобактерий, которые в большинстве своем не являются патогенными для человека и животных. М. bovis и M. tuberculosis особенно опасны. Методом ПЦР дифференциация видов осуществляется в течение 1–2 дней. Вторым примером может быть определение патогенного штамма В. аnthracis. Наряду с патогенным видом, вызывающим сибирскую язву, существуют так называемые «атипичные» виды, которые не представляют опасности для человека и животных. Методом ПЦР можно достоверно отличить эти виды и определить, когда заболевание представляет реальную угрозу.

— Быстрота (время обнаружения некоторых возбудителей методом ПЦР по сравнению с микробиологическим исследованием может сокращаться в 1–20 раз).

— Возможность определять маскированный возбудитель (возбудитель может находиться в маскированном состоянии, например, из-за агрегации клеточными структурами, или связывания с антителами.

— Возможность диагностики возбудителя в различных образцах (метод ПЦР можно использовать для определения патогена даже в таких образцах, как сперма животных. Например вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) в сперме животных можно определить только методом ПЦР. Прямое определение патогенов в сперме является важным при исследовании племенных животных).

Устройство ПЦР-лаборатории, что необходимо для проведения ПЦР:

1. Комната пробоподготовки и выделения РНК, ДНК.

Рис. 2.10.2.1. а — микроцентрифуга «Вортекс»; б — образцы для исследования; в — твердотельный термостат

2. Чистая зона.

Рис. 2.10.2.2. а — комната для смешивания компонентов ПЦР — тест-системы ПЦР; б — набор автоматических пипеток, пластиковые наконечники, пробирки

3. Комната для проведения амплификации и электрофореза, фотографирования гелей.

Рис. 2.10.2.3. а — аппарат для электрофореза; б — ультра-фиолетовый трансиллюминатор; в — амплификатор; г — полароид

Схема ПЦР. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа:

I этап цикла ПЦР: денатурация:

На этом этапе под действием высокой температуры (94–95 °С) происходит «расплавление» двухцепочечной ДНК, она переходит в однонитевую форму и свобождается место для «посадки» (гибридизации) праймеров.

Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2–3 мин для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

II этап цикла ПЦР: ПЦР: гибридизация (отжиг праймеров):

Когда цепи разошлись, температуру снижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 cек, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60–72 °C. Температуру отжига праймера можно оценить по эмпирической формуле:

T (°C) = 4(G + C) + 2 (A + T) – 3

где: A, T, G, C — число соответствующих нуклеотидов в одном праймере.

III этап цикла ПЦР: полимеризация:

(pdN)n + P₃dN = (pdN)n + 1 + PPi

где: (pdN)n — растущая цепь ДНК,

P₃dN — dNTP (дезоксинуклеотидтрифосфат),

(pdN)n + 1 — цепь ДНК, удлиненная на один нуклеотид,

PPi — пирофосфат.

В процессе ПЦР происходит экспоненциальное накопление фрагмента ДНК (после проведения 25–30 циклов — в 10⁶–10⁸ раз). В идеальном случае, наработка специфического фрагмента подчиняется закону 2n-2n раз, где n — число циклов, а 2n — продукт неопределенной длины, полученный в каждом цикле с исходной матрицы ДНК. Если необходимо определять РНК — добавляется дополнительная стадия: синтез к ДНК на матрице РНК — реакция обратной транскрипции (ОТ)

Учет результатов амплификации: (агарозный гель) представлен на рис. 2.10.2.4.

— Учет результатов амплификации проводится методом электорофореза в агарозном геле.

— Под действием электрического поля молекулы ДНК движутся от отрицательного (–) полюса к положительному (+).

— После просматривания геля в ультрафиолетовом свете можно говорить о результатах ПЦР (на геле видны светящиеся полоски).

— В положительных пробах положение полосы должно точно совпадать с положением полосы положительного контроля.

ПЦР в реальном времени» или Real-Time PCR

Особенность ПЦР в реальном времени — возможность регистрации результата ПЦР в процессе реакции, в каждый момент времени. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют ДНК-зонды. К зонду присоединены два химических соединения: флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. В ходе ПЦР происходит разрушение зонда, разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению свечения. Регистрируя интенсивность свечения, исследователь может узнать о ходе реакции без дополнительной стадии — электрофореза.

Рис. 2.10.2.4. Учет результатов амплификации: агарозный гель

Преимущества ПЦР в реальном времени:

— Существенное повышение специфичности метода за счет наличия внутреннего специфического зонда;

— Возможность количественного определения инфекционного агента;

— Надежность из-за снижения риска контаминации (информацию о составе пробы и о ходе реакции можно получить, не открывая пробирку)

— Возможность создания систем множественной ПЦР, позволяющих определять несколько возбудителей в одном образце;

— Снижение времени проведения реакции.

Компоненты диагностической системы на основе ПЦР.

Рис. 2.10.2.5. а — набор для выделения ДНК или РНК (+4 °С); б — набор для выявления патогенна (–20 °С); в — набор для проведения электрофореза (+4 °С)

Задания для самостоятельной работы

Задание 1. Ознакомиться с принципом постановки и необходимым оборудованием для проведения ПЦР.

Задание 2. Ознакомиться с этапами цикла и учетом результатов амплификации.

Задание 3. Изучить особенности ПЦР в реальном времени и компоненты диагностической системы, необходимые для проведения ПЦР?

Вопросы для самоконтроля знаний

1. Что лежит в основе ПЦР, каковы возможности применения ПЦР?

2. В чем преимущества и каковы характерные черты диагностики на основе ПЦР?

3. Что необходимо в лаборатории для проведения ПЦР?

4. Какие этапы включает каждый цикл амплификации?

5. Как осуществляется учет результатов амплификации?

6. Какова особенность ПЦР в реальном времени?

7. Какие компоненты диагностической системы необходимы для проведения ПЦР?

Глава 2.11. Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.11.1. Цель занятия

Приобрести теоретические знания и практические навыки для проведения ИФА.

2.11.2. Иммуноферментный анализ (ИФА)

Это лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

ИФА применяется для:

— массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним);

— выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах;

— определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;

— выявления иммунных комплексов;

— выявления онкомаркеров;

— определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.);

— определения общего IgE и специфических IgE антител;

— скрининга моноклональных антител;

— определения цитокинов в биологических жидкостях.

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1) стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса антиген + антитело;

2) стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания (введение ферментативной метки в комплекс);

3) стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал (визуализация продукта).

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы:

а) в конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

б) для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные:

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

Гомогенный ИФА применяется для определения низкомолекулярных субстанций. В его основе лежит ингибирование активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы — носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы — в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно-гетерогенным, если 1 стадия — образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

а) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу взаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

Компоненты, используемые в ИФА:

1.Ферменты. Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

— высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

— наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

— возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

— отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими, но и флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

2. Субстраты. Выбор субстрата определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

— обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

— образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

— субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов — флуоресцентных, хемилюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

3. Антигены и антитела. АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или моноклональными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG₂), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах.

4. Образование конъюгата. Конъюгат — это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата — один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент — способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело — антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно.

Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15–60% от свободного фермента).

Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1–2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5–10%).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70–90% от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

— высоким антительным титром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

— достаточной специфичностью в рабочем разведении;

— преобладанием мономерных форм над полимерными, так как полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

— оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

— достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

Твердая фаза. В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

— пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

— ковалентное прикрепление к твердой фазе;

— иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала.

Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами.

Наиболее популярные блокирующие агенты — бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др.

Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Варианты постановки ИФА

Общий принцип

Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем — стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Важный этап любого варианта твердофазного анализа — процедура отмывки от не связавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из всей глубины слоя. Это наиболее длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может производиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора — вошера или вручную, многоканальной пипеткой.

Для проведения ИФА необходимы:

— полистироловый планшет или другие использующиеся варианты твердой фазы;

— отмывающий раствор;

— конъюгат (меченные ферментной меткой антигены или антитела);

— смесь используемых субстратов;

— останавливающий раствор (Стоп-реагент — раствор для останавливания реакции);

— образцы, использующиеся для положительного и/или отрицательного контроля;

— стандартный антиген (для построения калибровочной кривой);

— одно- и многоканальные пипетки;

— вошер (промыватель);

— оптический прибор для определения оптической плотности исследуемого раствора (ИФА-ридер, считыватель, который последовательно фотометрирует все лунки);

— 5–100 мкл исследуемого биологическою материала.

Прямой ИФА:

1. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый материал). Выше отмечалось, что антигены существенно различаются по способности адсорбироваться на разных видах пластика в зависимости от того, к какому классу веществ (белкам, углеводам или липопротеинам) они принадлежат. Часто в прямом ИФА антиген, иммобилизованный на твердой фазе, это клетки и другие корпускулярные антигены.

Контроль. В качестве контроля используют лунки с адсорбированным положительным контрольным образцом, в котором обязательно содержится искомый антиген, и отрицательным контрольным образцом заведомо не содержащим исследуемого антигена. При наличии очищенного стандартного антигена реакцию проводят в нескольких разведениях, так чтобы можно было построить калибровочную кривую.

2. «Блокируют свободные места связывания, оставшиеся на твердой фазе, с помощью БСА казеина и др. (для предотвращения неспецифической сорбции конъюгата на твердой фазе).

3. В лунки вносят меченные ферментом антитела или антигены (конъюгат), инкубируют. Связывание конъюгата с твердой фазой будет происходить лишь в случае комплементарности обоих компонентов системы. После инкубации с коньюгатом лунки отмывают, удаляя, таким образом, не связавшуюся часть конъюгата.

4. Затем в лунки вносят субстрат, специфичный для используемого фермента, и инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем, ферментативную реакцию останавливают.

5. Учет реакции. Сначала результаты реакции учитывают визуально. Для более точного учета результатов интенсивность окрашивания оценивают на ИФА-ридере с соответствующим светофильтром. По результатам проведенного анализа строят график зависимости оптической плотносги от концетрации.

Непрямой ИФА. Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата. В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител к самым разным антигенам в любых образцах. Реакция методически проста.

Основные этапы непрямого ИФА для определения антител:

1. Антиген адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от несвязавшихся компонентов.

2. Блокируют свободные места связывания. Отмывают.

3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят процедуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.

4. Добавляют антиглобулиновый конъюгат в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от не связавшихся компонентов.

5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.

6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере.

При оптимальных условиях проведения анализа метод высокоспецифичен и чувствителен. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антител в исследуемых сыворотках. Для получения удовлетворительных результатов необходима стандартизация реагентов и методических приемов. Этот вариант ИФА может также использоваться для тестирования моноклональных антител. Схема непрямого ИФА представлена на рис. 2.11.2.1.

Рис. 2.11.2.1. Непрямой ИФА для выявления специфических антител

«Сэндвич» — вариант ИФА для выявления антигенов. Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно-разделенными эпитопами одинаковой специфичности. При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Основные этапы анализа:

1. На твердой фазе иммобилизуют моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела.

2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают.

3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела — конъюгат. После инкубации проводят отмывку.

4. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

5. Учет результатов на ИФА-ридере.

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем.

Конкурентный ИФА. Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы.

Конкурентный метод требует минимального числа операций, незначительного расхода реагентов и легко может бытъ автоматизирован. При проведении конкурентного ИФА для выявления антител лучше использовать меченые моноклинальные антитела, тогда конкуренция конъюгата с исследуемым образцом происходит за единственный эпитоп адсорбированного на твердой фазе антигена. Этот вариант ИФА применяется для определения различных соединений, таких как иммуноглобулины человека, раково-эмбриональный антиген, инсулин и др. Он позволяет выявлять антитела к диагностически значимым эпитопам инфекционных агентов. Схема постановки конкурентного ИФА представлена на рис. 2.11.2.2.

Основные этапы анализа для выявления антигена:

1. На твердой фазе иммобилизуют специфические для выявляемого антигена моноклональные антитела.

2. В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Проводят инкубацию и отмывку. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях.

3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

4. Учет реакции на ИФА-ридере.

В этом случае количество антигена в исследуемом образце обратно пропорционально ферментативной активности на твердой фазе.

Рис. 2.11.2.2. Постановка конкурентного ИФА

Ингибиторный ИФА. В этом варианте ИФА антиген, присутствующий в исследуемом образце, связывается с моноклональными антителами, меченными ферментной меткой, и ингибирует их взаимодействие со стандартным антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Присутствие в образце даже следовых количеств специфичного к конъюгату антигена будет ингибировать связывание меченых антител с иммобилизованным антигеном. Степень ингибирования прямо пропорциональна содержанию антигена в растворе. Для проведения количественного анализа строят кали6ровочную кривую с помощью последовательных разведений стандартного антигена. Основные этапы ингибиторного ИФА для выявления антигена:

1. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген. Подбирают рабочее разведение меченых антител с помощью титрования.

2. Проводят предварительную инкубацию конъюгата в разведении, предшествующем рабочему, с разведениями исследуемого образца, стандартного антигена и положительных контрольных проб.

3. Смесь переносят в лунки панелей. Для контроля 100%-ного связывания в несколько лунок вносят только меченые антитела, без ингибирующего антигена. Панели инкубируют, затем проводят отмывку.

4. Добавляют субстрат.

5. Проводят учет результатов.

Концентрация определяемого антигена в исследуемом образце обратно пропорциональна ферментативной активности на твердой фазе.

ИФА может использоваться не только для определения растворимого антигена или антитела, но и клеток, вырабатывающих различные белки.

Сравнительная схема конкурентного (а) и ингибиторного (б) ИФА представлена на рис. 2.11.2.3.

Рис. 2.