БИОХИМИЯ (практикум)
- -
- 100%
- +
Розанцева Любовь Эдуардовна Салитринник Леонид Израилевич
Суслянок Георгий Михайлович
БИОХИМИЯ
Лабораторный практикум
для подготовки студентов по направлениям
06.03.01 Биология
19.03.03 Продукты питания животного происхождения
36.03.01 Ветеринарно-санитарная экспертиза по специальности
36.05.01 Ветеринария
МОСКВА 2020
УДК
577.1(075.8)
ББК 28.072я73
Б63
Биохимия : лабораторный практикум /
Л.Э.Розанцева, Л.И. Салитринник, Г.М.Суслянок — М.: Издательство «Ким Л.А.», 2020 – 128с.
Практикум предназначен помочь студентам в усвоении теоретического курса по дисциплине «Биохимия» и должен быть использован при выполнении лабораторных работ. В практикуме представлено описание лабораторных работ по изучению строения, свойств и обмена важнейших биомолекул: белков, углеводов, липидов, ферментов, витаминов, гормонов. Часть работ посвящена биохимии мышечной ткани и крови. В конце каждой работы даются вопросы, позволяющие студенту самостоятельно проконтролировать свои знания.
ISBN 978-5-6044922-1-5
© Розанцева Л. Э. Салитринник Л.И. Суслянок Г.М., 2020
© Изд-во «Ким Л.А.», 2020
В В Е Д Е Н И
Е
Лабораторный практикум составлен в соответствии с учебными пла-нами и рабочими программами курса «Биохимия» и предназначен помочь студентам в усвоении теоретического курса по дисциплине. Пособие долж-но быть использовано при выполнении лабораторных работ, в процессе ко-торых студенты знакомятся с методами биохимического анализа, необходи-мыми в будущем для работы по направлению подготовки и специальности. Изложенные в лабораторном практикуме методики могут быть ис-пользованы в научно-исследовательской работе студентов в области
биотехнологии и ветеринарии.
ПРАВИЛА РАБОТЫ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Общие
положения
Во время работы в лаборатории соблюдайте чистоту, тишину, порядок.
По окончании пользования водой и источниками энергии немед-ленно закрывайте краны и выключайте электроприборы.
Не бросайте в раковину бумагу, вату, фильтры и другие предметы.
При замеченных неисправностях электрической проводки, водо-проводной сети, лабораторной аппаратуры, тяги, приборов немедленно сообщите об этом дежурному лаборанту или преподавателю.
Запрещается посторонним лицам посещать лабораторию и отвлекать от работы студентов; работать в лаборатории одному; пить и принимать пищу.
Правила техники безопасности
Работу в лаборатории необходимо выполнять в халатах из хлоп-чатобумажной ткани, застегивающихся спереди.
Все опыты с концентрированными кислотами, щелочами, газо-образными веществами, органическими растворителями (спиртом, аце-тоном, бензином и др.) производить под тягой. При работе со щелочью надевайте защитные очки.
При работе с воспламеняющимися веществами запрещается пользо-ваться открытым огнем. Нельзя нагревать горючие жидкости на открытом огне, на сетке, вблизи открытого пламени или в открытых сосудах.
Перед разборкой приборов, в которых содержатся воспламеняющи-еся вещества, необходимо вначале выключить находящиеся поблизости нагревательные приборы (электроплитки).
Нельзя выпаривать на столах растворы, выделяющие токсичные газы (сероводород, хлор, окислы азота).
Запрещается набирать кислоты и другие агрессивные жидкости в пипетку ртом, в этом случае следует пользоваться резиновой грушей или градуированными пробирками и бюретками.
Запрещается выливать в раковину крепкие кислоты, щелочи, ор-ганические растворители, ртуть и ее соединения, сильно пахнущие ве-щества. Их собирают в отдельную посуду с надписью.
При нагревании пробирок с растворами следует держать их специальным держателем открытым концом от себя и от стоящих рядом людей. Не пользоваться пробирками с трещинами.
При нагревании жидкостей с осадком надо быть осторожным во избежание выброса из сосуда горячей реакционной массы.
Запрещается проводить опыты в грязной посуде.
При работе с химическими веществами запрещается пробовать их на вкус.
При переливании агрессивных жидкостей необходимо пользо-ваться защитными очками, перчатками и фартуком.
При измельчении твердых кусков реактивов необходимо обер-нуть их плотной тканью и пользоваться защитными очками.
Запрещается оставлять без присмотра включенные электропри-боры. 15. Работать на центрифуге, аппарате для электрофореза и другом лабораторном оборудовании разрешается после детального ознакомле-ния с его техническим описанием и инструкцией по эксплуатации.
Первая помощь при несчастных случаях
При попадании на кожу щелочи обожженное место обильно про-мывают проточной водой, а затем протирают 2%-ным раствором уксус-ной или борной кислоты.
При попадании на кожу кислоты обожженное место обильно про-мывают проточной водой, а затем протирают 2%-ным раствором амми-ака или соды.
При сильных термических ожогах кожу смачивают крепким рас-твором перманганата калия или спиртовым раствором танина, спиртом, жировой эмульсией.
При поражении электрическим током, если пострадавший остается в соприкосновении с токоведущими частями, необходимо выключить ток при помощи пускателя, либо вывернуть предохранительные пробки, либо перерубить токопроводящий провод изолированным инструментом. Пока по-страдавший находится под током, нельзя прикасаться к нему без резиновых перчаток. До прибытия врача пострадавшему делают искусственное дыхание.
Тушение местного пожара и горящей одежды
При возникновении пожара потушите очаг пожара.
При возгорании одежды тушите ее водой или перекатыванием по-страдавшего по полу.
Р а з д е л I. Б
Е
Л
К
И
Белки — важнейшая составная часть живой клетки. Основой белковых молекул являются длинные полипептидные цепи, построенные из многих аминокислотных звеньев, причем каждый белок имеет свою, характерную для него, последовательность аминокислот. Поэтому белки — очень многочис-ленные и исключительно многообразные по своим функциям биомолекулы.
Аминокислоты в полипептидных цепях белков связаны прочными ко-валентными пептидными связями. Эти связи сохраняются при воздействии на белок денатурирующими факторами, но разрушаются при гидролизе.
При формировании белковой молекулы полипептидные цепи уклады-ваются определенным образом в пространстве: свертываются в плотную компактную структуру сферической формы (глобулярные белки) или укла-дываются в виде длинных нитевидных образований (фибриллярные белки). Вторичная и третичная структуры белковых молекул стабилизиру-ются и поддерживаются различными типами взаимодействий: водород-ными связями, электростатическим притяжением между противополож-но заряженными группами, гидрофобными взаимодействиями и кова-
лентными поперечными связями (дисульфидными).
Некоторые белки имеют четвертичную структуру, то есть состоят из нескольких белковых субъединиц, объединенных в одну гигантскую молекулу.
Работа
1.
ЦВЕТНЫЕ
РЕАКЦИИ
НА
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ
Присутствие аминокислот и белков в биологических объектах можно обнаружить с помощью специфических реакций. Некоторые химические вещества дают окрашенные продукты при взаимодей-ствии с аминокислотами и белками.
Существуют универсальные реакции, которые дают все белки (би-уретовая, нингидриновая). Кроме того, имеются специфические реак-ции (ксантопротеиновая, Миллона и др.), которые обусловлены наличи-ем только определенных аминокислот в структуре белка.
На основании цветных реакций разработаны методы качественного и количественного определения аминокислот и белков.
А.
Нингидриновая
реакция
Нингидриновая реакция характерна для α-аминокислот и обуслов-лена наличием в них свободной аминогруппы. Белки, пептиды, а также свободные α-аминокислоты, дают сине-фиолетовое окрашивание при нагревании с нингидрином (индан-1, 2, 3-трионгидрат).
При нагревании белка с избытком нингидрина аминокислота окис-ляется и распадается, образуя двуокись углерода, соответствующий аль-дегид и соединение сине-фиолетового цвета (комплекс Руэмана):
Интенсивность окраски зависит от количества аминокислот в ги-
дролизатах или свободных аминогрупп в молекуле белка. Реакция ши-
роко
используется
для
обнаружения
аминокислот
при
их
хроматографи-ческом разделении (см. раб.3).
Ход
работы
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую — 1 мл 1%-го раствора аминокислоты глицина и в третью —
1 мл 1%-го раствора аминокислоты β-аланина. В каждую пробирку до-бавляют по 3 капли 0,5%-го раствора нингидрина и нагревают в водяной бане до кипения.
Через 2–3 мин наблюдают появление окрашивания и объясняют разницу в окраске растворов в трех пробирках.
Б.
Биуретовая
реакция
Биуретовая реакция открывает в белке пептидную связь. Эту реак-цию дают все белки, продукты их неполного гидролиза (пептоны, пепти-ды), некоторые небелковые вещества (биурет H2 N–CO–NH–CO–NH2, оксамид H2 N–CO–СО–NH2) а также свободные аминокислоты в боль-ших концентрациях (гистидин, серин, треонин, аспарагиновая кислота). Биуретовая реакция обусловлена образованием окрашенного в си-
не-фиолетовый цвет медного комплекса. Полипептид в щелочной среде претерпевает полную енолизацию:
Енольная форма полипептида взаимодействует с гидроксидом меди и образует стабильное комплексное соединение:
Растворимый фиолетово-синий комплекс меди с белком
Ход
работы
В пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, добавляют 2 мл 1%-го раствора гидроксида натрия и 1 мл 1%-го раствора сульфата меди, появляется сине-фиолетовое окрашивание.
В.
Ксантопро
теиновая
реакция
Реакция обнаруживает в белке ароматические аминокислоты (фени-лаланин, тирозин, триптофан).
Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание.
Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца ароматиче-ских аминокислот с образованием нитросоединений жёлтого цвета:
Ход
работы
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую — 1 мл 1%-го раствора желатина, в третью — 1 мл 0,1%-го раствора триптофана. В пробирки вносят по 3 капли концентрирован-ной азотной кислоты, нагревают, охлаждают и добавляют несколько ка-пель 30%-гo гидроксида натрия.
Наблюдают появление окрашивания и объясняют разницу в окра-ске в трех пробирках.
Г.
Р
еакция
на
тирозин
(реакция
Миллона)
Реакция обнаруживает в белке аминокислоту тирозин. При добав-лении к раствору белка реактива Миллона (смесь нитратов Нg+ и Нg++ в концентрированной азотной кислоте) белок выпадает в осадок, а при нагревании приобретает красный цвет.
Реакция обусловлена образованием нитросоединений тирозина,
которые,
присоединяя
ртуть,
при
нагревании
превращаются
в
сложную смесь комплексных солей нитротирозина красного цвета:
Ход
работы
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую — 1 мл 1%-го раствора желатина, в третью — 1 мл 0,1% -го раствора тирозина. В каждую пробирку добавляют по 1 мл реактива Миллона и осторожно нагревают.
Наблюдают появление окрашивания в пробирках и объясняют разницу в окраске.
Д.
Р
еакция
на
триптофан
(реакция
Адамкевича)
Реакция обнаруживает в белке аминокислоту триптофан. При до-бавлении к раствору белка незначительных количеств глиоксиловой кислоты в присутствии крепкой серной кислоты получается красно-фи-олетовое окрашивание.
Реакция основана на способности триптофана вступать в реакцию с глиоксиловой кислотой в кислой среде, образуя при этом окрашенные продукты конденсации (смолы):
Ход
рабо
ты
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую — 1 мл 1%-го раствора желатина, в третью — 1 мл 0,1%-го раствора триптофана. В каждую пробирку в качестве источника гли-оксиловой кислоты добавляют по 1–2 мл концентрированной уксусной кислоты (глиоксиловая кислота всегда присутствует в небольших коли-чествах в ледяной уксусной кислоте).
Растворы слегка нагревают, затем охлаждают и по стенке пробир-ки осторожно, не допуская смешивания жидкости, добавляют по 2 мл концентрированной серной кислоты.
Через некоторое время в пробирке с яичным белком на границе двух слоев жидкости наблюдается красно-фиолетовое окрашивание в виде кольца. Появление окраски можно ускорить, поместив пробирку в кипящую водяную баню на 3 мин. Объясняют разницу в окраске рас-творов в трех пробирках.
Е.
Р
еакция
на
серосодержащие
аминокислоты (реакция Фоля)
Реакция Фоля открывает в белке серосодержащие аминокислоты цистин и цистеин, содержащие слабосвязанную серу. Метионин этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно.
При добавлении к раствору белка крепкой щелочи, уксуснокислого свинца с последующим кипячением раствор начинает темнеть. Реакция обусловлена тем, что при нагревании с крепкой щелочью цистин и ци-стеин разрушаются, образуя сульфид натрия:
Ацетат свинца взаимодействует со щелочью, образуя плюмбит натрия:
Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом образует черный осадок сульфида свинца:
Ход
работы
В одну пробирку вносят 1 мл 1%-го раствора яичного белка, во вторую 1 мл 1%-го раствора желатина, в третью — 1 мл 0,1%-го рас-твора цистеина. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 30%-го раствора гидроксида натрия и 1 мл 5%-го раствора ацетата свинца.
После интенсивного кипячения наблюдают появление окрашива-ния и объясняют разницу в окраске растворов в трех пробирках.
Ход и результаты всех цветных реакций на белки и аминокислоты по всем пунктам работы 1 оформляют в виде таблицы (табл. 1).
Таблица 1
№
п/п
Наименование
реакции
Исследуемый материал
и условия реакции
Наблюдаемое
окрашивание
Химизм
реакции
Контрольные
в
опросы
Назовите специфическую реакцию на α-аминокислоты. Объясните химизм этой реакции.
Какая химическая группа в белках и аминокислотах обусловлива-ет нингидриновую реакцию?
Назовите универсальную реакцию на белки. Объясните химизм этой реакции.
Какой химической группировкой в белках обусловлена биурето-вая реакция?
Какой реакцией обнаруживают ароматические аминокислоты?
Какую аминокислоту в белке открывают реакцией Миллона? ре-акцией Адамкевича? реакцией Фоля?
Объясните химизм цветных реакций на тирозин, триптофан, цистеин.
Реактивы
и
обору
дование
1. 1%-й раствор яичного белка: 1 г белка куриных яиц растворя-ют в 100 мл воды. 2. 1%-й раствор желатина. 3. 0,1%-е растворы тиро-зина, триптофана, цистеина. 4. 1%-е растворы глицина, α — аланина.
0,5%-й раствор нингидрина в 9%-ном ацетоне. 6. 10%-й раствор гидрок-сида натрия. 7. 1%-й раствор сульфата меди. 8. Концентрированная азот-
ная кислота. 9. Реактив Миллона: 200 г закисной ртути Hg2 (NO3)2 или
400 г окисной ртути Hg (NO3)2 растворяют в 1 л воды и добавля-
ют концентрированную азотную кислоту до просветления раствора.
10. Ледяная уксусная кислота. 11. Концентрированная серная кислота.
12. 30%-й раствор гидроксида натрия. 13. 5%-й раствор ацетата свинца.
14. Пробирки. 15. Пипетки. 16. Водяная баня.
Работа
2.
ГИДРОЛИЗ
БЕЛКОВ
Гидролиз связан с разрывом пептидных связей в молекуле белка и присоединением воды по месту разрыва.
Гидролиз можно осуществить при длительном кипячении белка в концентрированных растворах кислот и щелочей, а также фермента-тивным путем при температуре 37 ○С. Полный кислотный и щелочной гидролиз белка протекает за 20–24 часа, ферментативный — за 1–3 часа. При гидролизе белки вначале распадаются на полипептиды, три-
и дипептиды, а затем — на аминокислоты.
Ход
работы
В гидролизную термостойкую пробирку вносят 2 мл раствора яичного белка и 5 мл концентрированной соляной кислоты. Содержимое гидролизной пробирки осторожно перемешивают и отливают 1 мл рас-твора в чистую пробирку, которая будет являться контрольной.
Далее гидролизную пробирку закрывают воздушным холодиль-ником (резиновая пробка с длинной стеклянной трубкой) и помещают в кипящую водяную баню для проведения 2-часового гидролиза.
Через каждые 30 мин после начала гидролиза из гидролизной пробирки осторожно отливают по 1 мл гидролизата последовательно в 4 отдельные пробирки (количество отобранных проб зависит от про-должительности гидролиза). Эти 4 пробы считаются опытными.
С контрольной пробой и охлажденными под водой опытными пробами проводят биуретовую реакцию (см. работу 1, п.Б). Для этого к 1 мл исследуемого раствора добавляют 2 мл 30%-го раствора гидрок-сида натрия и 1 мл 1%-го раствора сульфата меди.
Отмечают изменение интенсивности окраски в опытных пробах по сравнению с контрольной и делают выводы.
Контрольные
в
опросы
Что такое гидролиз белков?
В чем химическая сущность гидролиза?
Какие существуют виды гидролиза?
Какие структуры белковой молекулы нарушаются при гидролизе?
Назовите промежуточные и конечные продукты гидролиза белков.
Как проводят кислотный гидролиз?
Укажите температуру и катализаторы кислотного и ферментатив-ного гидролиза.
Реактивы
и
обору
дование
1.Раствор яичного белка (яичный белок разводят водой в соотно-шении 1:5). 2. Концентрированная соляная кислота. 3. 30%-й раствор гидроксида натрия. 4. 1%-й раствор сульфата меди. 5. Гидролизная пробирка. 6. Стеклянная трубка с резиновой пробкой. 7. Водяная баня.
Пипетки на 1 и 5 мл. 9. Пробирки.
Раб
ота 3. РАЗДЕЛЕНИЕ СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ
МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Метод тонкослойной хроматографии основан на различной адсорб-ции составных частей смеси на выбранном адсорбенте. В качестве адсо-рбента используют бумагу, силикагели, крахмал, тальк, окись алюминия.
В последнее время все шире используют метод хроматографии в тонком слое пористого носителя (порошкообразного силикагеля или целлюлозы), нанесенного на стеклянную пластину или алюминиевую фольгу. Этот метод требует незначительных количеств разделяемых ве-ществ (0,01–0,005 мкг) и небольших затрат времени.
Нанесенные на силикагель аминокислоты (белковый гидролизат или смесь аминокислот-«свидетелей») при пропускании через него органи-
ческого растворителя переходят в подвижную фазу растворителя и, пе-ремещаясь вместе с ним с различной скоростью, разделяются. Скорость перемещения аминокислот зависит от химического состава аминокислот, от их способности растворяться в органическом подвижном растворителе и сорбироваться неподвижной фазой.