Цервицит

Для выявления антигенов T. vaginalis разработано несколько тестов. Как правило, чувствительность тестов для выявления антигенов трихомонад выше, чем чувствительность микроскопического метода исследования «нативного» препарата, но уступает (или сопоставима с ней) чувствительности культурального метода исследования. Бесспорным преимуществом данных тестов, по сравнению с традиционными методами диагностики трихомониаза, является то, что для интерпретации результатов исследования

не нужны живые трихомонады.

Прямое определение специфических белков T. vaginalis, таких как клеточный разъединяющий фактор (cell-detaching factor, СDF) и цистеин-протеаза (cysteine protease), являющихся иммуногенами всех наблюдавшихся

изолятов T. vaginalis, с использованием моноклональных антител в качестве быстрого метода диагностики трихомониаза показало результаты, аналогичные результатам метода микроскопии «нативного» препарата. Прямой иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализ выявления антигенов трихомонад в клинических материалах, полученных из влагалища, с использованием коммерческих тест-систем Trichomonas, использующий смесь меченных перокидазой и флюорохромом моноклональных антител к различным структурам T. vaginalis, показали аналитические характеристики, сравнимые с культуральным методом. Достоинством данного теста является также то, что результаты тестирования становятся доступны в течение одного часа.T. vaginalis может быть обнаружена методом прямой иммунофлюоресценции в отделяемом влагалища, а также иммунопероксидазным методом при цитологическом исследовании фиксированных цервикальных проб. Данные методы имеют достаточно высокую чувствительность (79– 90%) и специфичность (98–100 %) по сравнению с культуральным методом. Недостатком иммунологических методов является то, что для их выполнения требуются специальное оборудование; кроме того, эти методы достаточно дороги.

Для детекции T. vaginalis существует ряд методов определения их антигенов и предназначены для женщин с клиническими симптомами, что делает их неинформативными для других пациентов. Последнее поколение данных тестов – быстрый тест для выявления трихомонад.

В отечественной клинической практике пока «вспомогательными» остаются иммунологические и молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики влагалищных трихомонад, направленные на выявление либо видоспецифичных антигенных маркеров T. vaginalis (экспресс-тест), либо консервативных нуклеотидных последовательностей, характерных для T. vaginalis (например, часть гена бета-тубулина, повторяющийся фрагмент TV-E650 и др.), и отличающих их от иных простейших и других частых «сателлитных» возбудителей ИППП – Chlamуdia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis (с применением ПЦР- и ЛЦР-технологий).

ПЦР-тестирование (при условии использования высокоспецифичных и качественных праймеров) сегодня является, пожалуй, единственным надежным способом видовой дифференциации T. vaginalis от трихомонад других видов (T. tenax, T. hominis), которые в связи с изменением в последнее время стереотипов сексуального поведения (промискуитет, гомосексуальные, орально-генитальные и анально-генитальные контакты) могут быть обнаружены в образцах из урогенитального тракта, ротовой полости или прямой кишки. Несмотря на свой высокий диагностический потенциал, ПЦР-типирование T. vaginalis по нормативным документам пока не относится к категории арбитражных методов.

Получение клинических образцов. Для выявления T. vaginalis у женщин наиболее подходит материал из влагалища. Мазок с заднего свода берут дакроновым или вискозным тампоном на пластиковом стержне. Ватные тампоны на деревянных стержнях подходят для микроскопии и инокуляции в культуру, но не подходят для экспресс-тестов и МАНК. Поэтому, чтобы не путаться, рекомендовано не применять зонды с ватой. Производить забор материала пациентки могут самостоятельно, либо это могут делать врачи до размещения влагалищного зеркала в ходе гинекологического осмотра.

Также для МАНК на T. vaginalis подходит материал (из влагалища, шейки матки, моча), оставшийся при сборе анализов на хламидии или гонококки.

Чувствительность к химиопрепаратам. Редко встречаются, но описаны изоляты T. vaginalis с пониженной чувствительностью и резистентностью к метронидазолу (который обычно выступает первой линией терапии) и тинидазолу (вторая линия терапии). Тем не менее, в некоторых популяциях резистентность к метронидазолу обнаруживают в 2-5% случаев трихомониаза у женщин.

Оппортунистические инфекции

Особенности оппортунистических инфекций – полиэтиологичность, полиорганность, склонность к генерализации процесса, малая специфичность клинических проявлений. В их развитии играют роль как экзогенные возбудители (микоплазмы и др.), так и представители резидентной микрофлоры (эндогенные микроорганизмы), а также состояние иммунной системы организма.

Основными формами оппортунистических инфекций являются: гнойно – воспалительные процессы, бактеремия, сепсис, бактериальный эндотоксический шок, дисбактериозы (дисмикробиоценозы – дисбиозы).

Если патогенные микроорганизмы вызывают классические инфекции, то условно – патогенные микроорганизмы вызывают инфекции у лиц с нарушениями иммунного статуса (оппортунистические инфекции). В зависимости от этиологии и патогенеза иммунодефицита манифестируют различные инфекции и инвазии. При дефиците гуморального иммунитета преоб-ладают бактериальные инфекции, при преимущественном клеточном иммунодефиците – вирусные, протозойные и грибковые.

В современной патологии человека предполагается этиологическая роль около 100 видов условно-патогенных микроорганизмов. Основное значение среди них имеют представители следующих родов: Staphylococcus, Streptococcus, Peptostreptococcus, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Acinetobacter, Bacteroides, Bacillus, Mycobacterium, Mycoplasma, Candida, Cryptococcus, Pneumocysta.

На модели СПИД из большого числа известных оппортунистических инфекций установлен стандартный перечень 13 оппортунистических (иммунодефицит – индикаторных) инфекций, вызываемых простейшими (Toxoplasma gondii, Isospora belli, Cryptosporidium spp.), грибами (Pneumocystis carinii отнесены к бластомицетам – почкующимся дрожжеподобным грибам; Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis), бактериями (Salmonella spp., Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex), вирусами (Herpes simplex, Cytomegalovirus hominis). По данным многих авторов, примерно у половины больных СПИДом в клинике доминирует пневмоцистная пневмония, у четверти – саркома Капоши (предположительно вызывается вирусом герпеса человека 8 типа – ВГЧ8), часто проявляются инфекции, вызываемые различными герпес- вирусами, кандидоз.

Таким образом, если при клинике цервицита определяется микст – инфекция, в том числе кандидозная, герпетическая, микобактериальная, то естественным будет суждение врача о том, что цервицит протекает в организме с выраженным иммунодефицитом. При этом обращает на себя внимание крайняя таксономическая разнородность инвазий (вирусы, бактерии, грибы) и двуликость форм инфекционного процесса – латентное бессимптомное течение (чаще при улучшении иммунного статуса) или склонность к распространению (при прогрессировании иммунодефицита, например, при беременности).

Развитие и течение оппортунистических инфекций (лат.opportunas – склонный к заболеванию) определяются тремя группами факторов: свойствами возбудителя, состоянием макроорганизма и внешней среды. Со стороны возбудителя решающее значение в возникновении инфекции имеет высокая и гетерогенная по патогенности инфицирующая доза возбудителя и наличие у него определенного набора факторов вирулентности. Со стороны организма человека – нарушение целостности покровов и, что наиболее существенно, иммунодефицитные состояния. Значение окружающей среды связано с наличием факторов передачи возбудителя от инфицированного человека не инфицированному.

Возбудители оппортунистических инфекций не имеют строго выраженного органного тропизма, вследствие чего один и тот же вид может вызвать различные нозологические формы. В свою очередь одна и та же нозологическая форма заболевания (пневмония, сепсис и др.) может быть вызвана любым условно-патогенным микроорганизмом.

Оппортунистические инфекции часто вызываются ассоциацией микроорганизмов. Смешанные, или микст-инфекции, возникают в результате одновременного, а чаще последовательного заражения человека несколькими видами возбудителей.

Клиническая картина оппортунистических инфекций малоспецифична. Она зависит в большей мере от локализации поражения, чем от вида возбудителя. Для этих инфекций характерно хроническое течение. В основе хронизации лежит иммунодефицит, а также смена вариантного или видового состава возбудителей в течение болезни.

Эти же факторы обусловливают склонность оппортунистических инфекций к генерализации, развитию септикопиемии.

К особенностям оппортунистических инфекций относится так же сложность лечения, которая связана с множественной устойчивостью возбудителей к антимикробным препаратам, недостаточной активностью факторов неспецифической защиты, а также слабым иммунным ответом организма больного на антигены возбудителя. В связи с этим главным принципом лечения оппортунистических инфекций является сочетанное применение препаратов микробицидного действия и иммуностимулирующей терапии. Вместе с тем оппортунистические инфекции отличаются от заболеваний, вызванных облигатно-патогенными микроорганизмами, такими эпидемиологическими особенностями, как широкое распространение в больничных стационарах, частые случаи эндогенной инфекции.

В диагностике оппортунистических инфекций решающими являются микробиологические методы исследования. В их задачу входит установление возбудителя (возбудителей) болезни, определение иммунологического статуса больного, выяснение источника и факторов передачи возбудителей.

В установлении этиологии заболевания основное значение имеет выделение чистой культуры возбудителя из патологического материала. Однако выделение культуры условно-патогенного микроорганизма от больного еще не подтверждает его участия в развитии патологического процесса, поскольку большинство условно-патогенных микроорганизмов обитают у всех или большинства здоровых людей.

Поэтому при диагностике оппортунистических инфекций в качестве обязательного предусмотрен количественный критерий, под которым понимают количество колониеобразующих клеток выделяемого вида микроорганизма в 1 мл исследуемого материала.

1.4.Virus herpes simplex

Морфологические и биохимические особенности. Вирионы обладают сферической формой с диаметром 140-210 нм. Нуклеокапсид окружен внешней оболочкой. Капсид построен из 162 капсомеров. Геном вируса представлен линейной двунитевой ДНК, которая состоит из двух ковалентно связанных между собой фрагментов, различных по величине и нуклеотидному составу, содержится около 80 генов.

В составе вириона обнаружено более 300 белков. Кроме того, в инфицированных клетках находится еще около 20 вирусоспецифических белков,

которые не входят в состав вирусных частиц. Во внешней оболочке содержатся гликопротеины.

Антигены. Гликопротеины внешней оболочки являются типоспецифическими антигенами, позволяющими дифференцировать отдельные серотипы вирусов герпеса в реакциях нейтрализации, иммунофлюоресценции, РСК. Белки нуклеокапсида в основном несут группоспецифические антигенные эпитопы, одинаковые для отдельных вирусов герпеса, патогенных для человека или животных. Их выявляют в реакциях преципитации в иммунодиффузии.

Культивирование и репродукция. ВПГ – 2 размножается во многих различных тканевых культуральных системах: в монослоях эпителиальных клеток почек кролика, обезьяны, амниона человека, куриного эмбриона. Его цитопатогенное действие может проявляться на 2-3 день, когда отдельные клетки начинают округляться и появляются гигантские клетки, содержащие 100 ядрышек. В этот период можно видеть внутриядерные включения.

Вирусы герпеса проникают в чувствительные клетки путем рецепторного эндоцитоза, в процессе которого утрачивают внешнюю оболочку. Освободившийся нуклеокапсид транспортируется в ядро, где происходит его депротеинизация. Транскрипция вирусной ДНК происходит при участии клеточных транскриптаз, а ее репликация – с помощью вирусоспецифической ДНК-полимеразы. Структурные белки транспортируются в ядро, где образуются нуклеокапсиды. Формирование вируса заканчивается в процессе почкования через модифицированные участки ядерной мембраны, когда нуклеокапсид покрывается внешней оболочкой. Синтез вирусов герпеса происходит на фоне резко ослабленного макромолекулярного синтеза компонентов клетки хозяина. В ядрах инфицированных клеток формируются вирусспецифические эозинофильные включения, состоящие из кристаллизирующихся капсидов.

Краткая эпидемиологическая характеристика. ВПГ-2 поражает преимущественно лиц, которые достигли половой зрелости, передаваясь половым путем с развитием генитального герпеса, а также новорожденных, которые инфицируются при прохождении через родовые пути матери. Кроме того, ВПГ-2 нередко встречается при раке шейки матки.

Лабораторная идентификация. Материалом для лабораторного анализа может служить содержимое везикул, соскоб со дна эрозии, цервикального канала. Получение инфицированных клеток для проведения цитологического исследования и реакции иммунофлюоресценции (РИФ) достигается нанесением полученного от больной материала на стекло и высушивания его на воздухе. Для выделения ВПГ на культуре клеток, выполнения иммуноферментного анализа (ИФА) (для выявления антигена) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) биологическое отделяемое помещается в пробирки, содержащие стерильный раствор среды 199 (для работы на культуре клеток) или физиологический раствор (для проведения ПЦР), в которых доставляется в лаборатории.

При цитологическом исследовании мазок после фиксации спиртом и окрашивания гематоксилином и эозином рассматривается в световом микроскопе с целью обнаружения многоядерных гигантских клеток с внутриядерными включениями.

При РИФ мазки после фиксации охлаждённым ацетоном, помещают в чашку Петри с увлажнённой фильтровальной бумагой на дне, наслаивают на мазок разведённые флюоресцирующие иммуноглобулины, выдерживают в термостате, промывают, высушивают и рассматривают в люминисцентном микроскопе. Обращают внимание на характер и количество антигенсодержащих клеток, локализацию специфического свечения и его интенсивность. Положительным считается мазок, в котором содержится не менее 3 морфологически неизмененных клеток эпителия с интенсивной специфической флюоресценцией типичной локализации не менее чем ++. Для ВПГ – 2 характерна локализация антигена в ядре, ядре и цитоплазме одновременно.

Чаще всего вирус удается выделить из отделяемого канала шейки матки. Он редко определяется одновременно во всех образцах, полученных от больной, поэтому для уменьшения диагностических ошибок необходимо исследовать максимальное число образцов от одной пациентки.

Частота выделения антигена ВПГ – 2 у женщин в значительной мере зависит от фазы менструального цикла. Более чем у 70% пациенток, страдающих простым герпесом, он выделяется в начале лютеиновой фазы. В это же время отмечается усиление клинических проявлений ВПГ-инфекции у основного числа больных. Реже ВПГ выделяется в пред- и постменструальном периодах (у 12—30% больных). Частота выявления ВПГ у больных в остальные дни менструального цикла снижается до 5—8% . Значительный разброс в выявлении антигена ВПГ у женщин в различные дни менструального цикла показывает, что отрицательный результат однократного вирусологического исследования не может исключить полностью диагноз генитального герпеса. При подозрении на ВПГ- 2 инфекцию необходимо проводить повторное 1 раз в 7 дней, т.е. 2—4 раза в течение месяца вирусологическое исследование отделяемого мочеполовой системы у пациенток.

В специализированных вирусологических лабораториях вирус выделяют из инфицированного материала, полученного от больных, с помощью биологического метода, который состоит в изоляции ВПГ из клинического материала путем заражения культур клеток (выделение in vitro) или лабораторных животных, чувствительных к ВПГ (выделение in vivo). При выделении вируса в культуре клеток диагноз ставится через 24—48 часов и более на основании характерного цитопатического действия (ЦПД), которое оказывает ВПГ на клетки. Для выделения ВПГ in vivo можно использовать 12—13-дневные куриные эмбрионы и лабораторных животных (морских свинок, хомяков, крыс, собак, обезьян), у которых развиваются типичные для ВПГ- 2 инфекции симптомы.

Диагностическая ценность серологических методов при простом герпесе различна и зависит от формы инфекции (первичная, рецидивирующая), состояния реактивности организма больного, длительности заболевания и ряда других факторов.

В ответ на внедрение ВПГ в серонегативном организме начинается продукция специфических иммуноглобулинов класса М (IgM), которые определяются на 4— б день после инфицирования и достигают максимального значения на 15—20 сутки. С 10—14 дня начинается продукция специфических иммуноглобулинов G (IgG), несколько позднее – IgA. IgM и IgA сохраняются в организме человека недолго (1-2 месяца), IgG – в течение всей жизни (серопозитивность).

Диагностическое значение при первичной герпетической инфекции имеет выявление IgM и (или) четырехкратное увеличение титров специфических IgG в парных сыворотках крови, полученных от больной с интервалом 10—12 дней.

Рецидивирующий герпес обычно протекает на фоне высоких показателей IgG, свидетельствующих о постоянной антигенной стимуляции организма больной. Появление IgM у такой пациентки говорит об обострении болезни.

Для установления ВПГ-инфекции в диагностически сложных случаях необходимо комплексное вирусологическое обследование больных, включающее обнаружение антигена и анализ серологических показателей в динамике. Постановка диагноза герпетического цервицита только на основании серологического исследования может повлечь за собой диагностическую ошибку, так как низкие титры противо- герпетических IgG не всегда доказывают отсутствие активной герпетической инфекции. Выявление же титров IgG выше средних является показанием к дополнительному обследованию пациентки с целью подтверждения или исключения диагноза ВПГ- инфекции (табл. 3).

Таблица 3

Методы идентификации ВПГ

Метод идентификации ВПГ

Чувствительность, %

Специфичность, %

Сроки постановки реакции

на культуре клеток и на животных по ЦПД

80 – 100

100

2 – 7 дней

по антигену:

РИФ (прямой и непрямой метод),

иммуноферментный метод (ИФА),

иммунопероксидазный метод

70 – 75

90

1 – 2 часа

по ДНК:

полимеразно-цепная реакция (ПЦР),

ДНК – гибридизация in vitro и in situ

95

90 – 100

1 – 2 дня

по морфологии инфицированных клеток:

в световом микроскопе

в электронном микроскопе

50 – 80

10 – 80

80

100

1 – 2 часа

по антителам –

специфическим IgG и IgM (метод ИФА)

90 – 95

90 – 95

4 – 6 час

1.5. Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum

Микоплазмы – самые мелкие прокариотические микроорганизмы, не имеющие клеточной стенки (это придает им сходство с L – формами бактерий) и способные к паразитированию на мембранах эукариотических клеток. Способность персистировать на мембранах клеток связана с наличием сходства структуры и состава цитоплазматической мембраны микоплазм с мембранами клеток эукариот и использовании микоплазмами их компонентов (прежде всего холестерина и фосфолипидов) для построения собственных структур. Микоплазмы имеют трехслойную цитоплазматическую мембрану, обеспечивающую целостность микробных клеток и частично замещающую в функциональном отношении отсутствующую клеточную стенку.

Основные характеристики микоплазм: отсутствие истинной клеточной стенки, мелкая кокковидная форма, паразитизм на мембранах эукариотических клеток, рост на плотных средах в виде мелких врастающих в агар колоний с приподнятым центром (“яичница – глазунья”), абсолютная резистентность к пенициллинам и другим действующим на синтез клеточной стенки антибиотикам. Характеризуются малым размером генома, низким содержанием Г+Ц в ДНК. Имеют от 104 до 113 нуклеотидов в 5S рРНК.

M.hominis, M.genitalum, M.fermentans вызывают инфекции, при которых преобладают урогенитальные поражения.

В составе рода Ureaplasma штаммы, выделенные от людей, составляют вид U.urealyticum.

Морфология

Наиболее типичны мелкие кокковидные формы, выражен полиморфизм.

Культуральные и биохимические свойства

Микоплазмы и уреаплазмы прихотливы к условиям культивирования. В составе сред необходимы холестерин и стерины, нативные сыворотки, витамины, соли. Основным источником энергии являются углеводы (особенно глюкоза) или аминокислоты (аргинин). Для усиления восстановительных свойств сред добавляют L- цистеин.Оптимум температуры для культивирования от + 35 до +37С.

Оптимум рН для глюкозоверментирующих микоплазм (M.genitalium, M.fermentans, M.pneumoniae) – около 8,0. Эти микоплазмы ферментируют глюкозу до углекислого газа со сдвигом рН в кислую сторону и изменением цвета среды с зеленого на желто – лимонный.

Колонии уреаплазм (ранее называли Т- микоплазмами (от “tiny -маленький”) значительно меньше колоний классических микоплазм, на средах с добавлением сульфата марганца их колонии окрашиваются в золотисто – коричневый цвет, в отличии от микоплазм уреаплазмы мало чувствительны к небольшим дозам линкомицина (15 мкг/ мл).

Антигенная структура

Микоплазмы характеризуются выраженной гетерогенностью и изменчивостью антигенной структуры (антигенный полиморфизм). Известно 16 серотипов U.urealyticum, разделенных на серогруппы А и В. Степень гомологии серотипов существенно отличается. Часто выделяют от больных смешанные культуры различных серотипов. Выделяют биовары уреаплазм, отличающиеся по вирулентности и строению гена основного фермента – уреазы. Аналогичная динамичность и гетерогенность антигенной структуры и наличие различных сероваров характерна и для различных видов классических микоплазм. По биохимическим и в определенной мере антигенным свойствам среди микоплазм имеются виды – двойники (например, M.pneumoniae и M.genitalium). Среди антигенов выделяют белки – адгезины, фосфо – и гликолипиды, полисахаридные компоненты.

Факторы патогенности

1. Адгезины (обеспечивают взаимодействие с клетками хозяина).

2. Эндотоксины (не тождественны ЛПС грамотрицательных бактерий).

3. Гемолизины.

4. Ферменты – фосфолипаза А, аминопептидазы, протеазы, нейраминидаза.

Патогенез.

Микоплазмы – мембранные паразиты и способны адсорбироваться на различных эукариотических клетках. Этому способствует подвижность патогенных микоплазм, связанная с хемотаксисом и наличием микроворсинок. Микоплазмы способны тесно связываться с мембранами эукариотической клетки, вступать в межмембранное взаимодействие, обмениваться мембранными компонентами (в том числе использовать холестерин и стенолы для построения собственных клеток), оказывать разнообразное влияние на клетки. Коротко остановимся на основных эффектах действия микоплазм на различные клетки.

1. Взаимодействие с фагоцитирующими клетками вызывает цитопатический или цитотоксический эффект и гибель фагоцитов или приводит к длительной персистенции микоплазм в фагосомах фагоцитов.

2. Воздействие микоплазм на макрофаги приводит к нарушению их функций.

3. Персистенция микоплазм на мембранах лимфоидных клеток оказывает существенное влияние на их функции, в том числе непосредственное деструктивное воздействие на иммунокомпетентные клетки (M.fermentans оказывает СПИДо – подобное действие на иммунную систему).

4. Микоплазмы действуют на эритропоэз, т.е. на гомеостаз организма.

5. Обмен антигенными компонентами мембран с клетками хозяина обеспечивает антигенную мимикрию и развитие аутоиммунных реакций.

6. Отсутствие клеточной стенки и частая локализация микоплазм в инвагинатах мембран клеток объясняет их слабую иммуногенность и защиту от действия антител. Этому способствует также высокая антигенная изменчивость молликут.

7. Микоплазмы способны воздействовать на хромосомный аппарат клеток хозяина (на соматические и половые клетки), вызывая хромосомные абберации.

8. Ряд продуктов метаболизма оказывает токсическое воздействие на инфицирован-ные клетки. Так, глюкозоферментирующие микоплазмы резко снижают рН и оказывают этим деструктивное действие на эпителиальные клетки.