Руководство к практическим занятиям по биохимии. Учебное пособие для студентов специальностей «Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза»

Утверждено РИС Учёного совета Медицинского института Российского университета дружбы народов

Авторский коллектив:

Т. А. Лобаева, Е. В. Неборак, И. П. Смирнова

Рецензенты:

Смирнова Ксения Валерьевна – к.б.н., зав. лабораторией вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России

Шатова Ольга Петровна – к.м.н., доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Предисловие

В предлагаемом читателю Руководстве авторы попытались подвести некоторые итоги опыту постановки и проведения лабораторно-практических занятий на кафедре биохимии имени академика Т. Т. Берёзова МИ РУДН для студентов 2 курса специальностей «Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза».

Основной задачей занятий по биохимии по специальности «Ветеринария» на втором курсе является обучение студента чёткой формулировке цели исследования, овладению методическими приёмами исследования, проведению самого опыта. В перечень проводимых работ дополнительно включены демонстрационные работы, которые помогут студентам лучше овладеть знаниями курса биохимии, а также календарные планы практических и лекционных занятий.

Перед выполнением каждой лабораторной работы дано краткое изложение теоретических положений, подробно приводится описание хода работ в виде удобных таблиц, позволяющих легко оформить полученный результат. В конце каждого раздела имеются контрольные вопросы, целью которых является выработка у будущего специалиста самостоятельного осмысления связи между полученными данными эксперимента и установившимися теоретическими положениями.

Предлагаемые работы полностью соответствуют программе дисциплины «Биохимия» для специальности «Ветеринария» и составлены в соответствии с лекционным курсом, читаемым на кафедре биохимии им. акад. Березова Т. Т. МИ РУДН.

В указатель литературы внесены лишь названия книг, методических пособий, которые использовались ранее при составлении Руководства для выполнения практических работ на кафедре биохимии. Авторы не сочли целесообразным в настоящем Руководстве давать ссылки на оригинальные статьи, используемые в описании работ. Дополнения, как правило, вносились в связи с поставленными в опыте задачами и обозначались знаком в виде *.

Все указания и критические замечания будут приняты авторами с глубокой признательностью.

Общие правила техники безопасности в биохимической лаборатории

Важное правило для студентов:

Если вы испытываете какие-либо сомнения в методике эксперимента или в технике безопасности, прежде чем продолжить работу, проконсультируйтесь с Вашим преподавателем.

1. Приступая к выполнению практической работы, необходимо внимательно ознакомиться с инструкцией или методикой.

2. Работать в учебной биохимической лаборатории следует только в отведённое для этого время под контролем преподавателя.

3. Все манипуляции с химическими реактивами, посудой и приборами должны проводиться в спецодежде (медицинский халат, при необходимости – перчатки).

4. Во время выполнения работы следует соблюдать порядок и чистоту.

5. Следует избегать вдыхания паров или газов; никакие вещества в лаборатории нельзя пробовать на вкус, запрещается пить, принимать пищу, курить.

6. Нельзя нагревать, смешивать и взбалтывайте реактивы вблизи лица. Отверстие химического сосуда следует направлять в сторону, противоположную от лица и тела. Нельзя засасывать жидкость в пипетку ртом, необходимо пользоваться специальным приспособлением для наполнения пипеток.

7. Необходимо соблюдать особую осторожность при работе с сильными кислотами или щелочами, особенно при нагревании. Нельзя добавлять воду к концентрированным кислотам или щелочам.

8. Категорически запрещается уже отмеренные реактивы сливать (высыпать) обратно в сосуды, из которых их отмеряли.

9. Запрещается выливать в раковины концентрированные растворы щелочей и кислот, органические растворители, легковоспламеняющиеся, горючие вещества, щелочные металлы. Все указанные отходы должны обязательно собираться в специальные ёмкости.

10. Недопустимо оставлять во включенном состоянии без присмотра газовую горелку и электрические приборы.

11. О любых ситуациях, способных нанести вред здоровью, необходимо немедленно информировать преподавателя.

Список сокращений и условных обозначений

АДФ – аденозинтрифосфат

АМК – аминокислота

АМФ – аденозинмонофосфат

цАМФ – циклический АМФ

АТФ – аденозинтрифосфат

АТФаза – аденозинтрифосфата

ВЖК – высшая жирная кислота

ГАФ – глицеральдегид-3-фосфат

ГДФ – гуанозиндифосфат

ГМФ – гуанозинмонофосфат

ГТФ – гуанозинтрифосфат

ДАГ – диацилглицеролы

ДАФ – диоксиацетонфосфат

α-КГ – α-кетоглутаровая кислота

КоА – кофермент (коэнзим) А

КоQ – кофермент (коэнзим) Q

КФ – классификация ферментов

ЛП – липопротеины

ЛПВП – липопротеины высокой плотности

ЛПНП – липопротеины низкой плотности

ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности

МАГ – моноацилглицеролы

МАО – моноаминооксидаза

НАД+ – никотинамидадениндинуклеотид окисленный

НАДН(Н+) – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

НАДФ+ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

НАДФН(Н+) – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

ПВК – пировиноградная кислота

ПФ – пиридоксальфосфат

СДГ – сукцинатдегидрогеназа

ТАГ – триацилглицеролы

ТХУ – трихлоруксусная кислота

УДФ – уридиндифосфат

УМФ – уридинмонофосфат

УТФ – уридинтрифосфат

ФАД – флавинадениндинуклеотид окисленный

ФАДН2 – флавинадениндинуклеотид восстановленный

ФЕП – фосфоенолпируват

ФМН – флавинаденинмононуклеотид

Фн – неорганический фосфат

ФФн – неорганический пирофосфат

ФФК – фосфофруктокиназа

ФЭК – фотоэлектроколориметр

ХЭ – холинэстераза

ЦТК – цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

ЩУК – щавелевоуксусная кислота

D – оптическая плотность

Dоп – оптическая плотность опытного

образца

Dст – оптическая плотность стандартного образца

Dк – оптическая плотность контрольного образца

КМ – константа Михаэлиса

Vmax – максимальная скорость реакции

Календарный план проведения лекций и практических занятий по биохимии

для студентов 2 курса по специальности «Ветеринария» и «Ветсанэкспертиза» (1 ч. лекции, 2 ч. – практические занятия)

1 неделя. Основные классы биологических соединений. Уровни структурной организации белка. Связь структуры белков с их биологическими функциями. Простые и сложные белки.

3 неделя. Ферменты. Строение ферментов. Природа активного центра. Аллостерическая регуляция. Изоферменты. Свойства ферментов, специфичность действия. Ингибиторы ферментов. Роль коферментов в реакциях обмена веществ. Применение ферментов.

5 неделя. Гормоны. Классификация гормонов. Механизмы действия гормонов. Примеры гормональной регуляции обмена веществ.

7 неделя. Введение в обмен веществ и энергии. Обмен углеводов. Распад и синтез гликогена в печени и мышцах. Анаэробный распад углеводов: гликолиз и гликогенолиз. Энергетический эффект. Глюконеогенез.

9 неделя. Аэробный обмен углеводов. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Цикл Кребса, его энергетический эффект. Понятие о пентозофосфатном пути превращения углеводов. Регуляция углеводного обмена.

11 неделя. Обмен липидов. Классификация липидов. Значение микрофлоры рубца в переваривании липидов. Превращение глицерина и его роль. β-окисление жирных кислот. Энергетический эффект распада пальмитиновой кислоты.

13 неделя. Особенности распада жирных кислот у жвачных животных. Роль ацетил-КоА в обмене липидов. Биосинтез жирных кислот. Метаболизм кетоновых тел. «Кетозы». Роль холестерина в обмене веществ. Обмен белков. Биологическая и кормовая ценность белков.

15 неделя. Обмен простых белков. Влияние недостаточности аминокислот и белка на развитие животных. Пути превращения аминокислот. Превращения аминокислот в кишечнике, в тканях. Декарбоксилирование аминокислот. Дезаминирование аминокислот. Пути обезвреживания аммиака. Орнитиновый цикл мочевинообразования.

17 неделя. Обмен сложных белков. Обмен нуклеопротеинов. Распад и биосинтез пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. Особенности обмена белка у птиц. Обмен хромопротеинов. Взаимосвязь обмена белков, липидов и углеводов.

1 неделя. Вводная беседа. Семинар по теме: «Химия белков, аминокислоты».

2 неделя. Лабораторная работа «Цветные реакции на белки и аминокислоты». Лабораторные работы «Диализ белков», «Хроматография аминокислот». Семинар «Простые и сложные белки». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

3 неделя. Семинар «Нуклеиновые кислоты. Структура ДНК и РНК и их биологическая роль», «Витамины». Лабораторная работа «Количественное определение витамина С в картофеле». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

4 неделя. Семинар по теме «Ферменты, коферменты, витамины». Лабораторная работа «Действия амилазы на крахмал». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

5 неделя. Коллоквиум 1 «Аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты. Ферменты и витамины». Контрольная работа.

6 неделя. Семинар «Гормоны». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

7 неделя. Семинар «Обмен углеводов. Регуляция обмена углеводов». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос). Лабораторная работа «Определение продукта ферментативного расщепления крахмала».

8 неделя. Семинар «Обмен углеводов. Пентозофосфатный путь». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

9 неделя Семинар «Биологическое окисление». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

10 неделя. Коллоквиум по Модулю 2 «Гормоны. Обмен углеводов». Контрольная работа.

11 неделя. Семинар «Обмен липидов. Регуляция липидного обмена». Лабораторная работа «Кинетика действия свиной липазы». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

12 неделя. Семинар «Обмен липидов: распад и синтез высших жирных кислот. Расчет энергетического эффекта распада высших жирных кислот». Лабораторная работа «Определение некоторых веществ в образцах мочи человека». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

13 неделя. Семинар «Обмен белков и аминокислот: переваривание, всасывание, пути превращения». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос). Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

14 неделя. Семинар «Обмен белков и аминокислот: токсичность и нейтрализация аммиака в организме». Лабораторная работа «Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

15 неделя. Семинар по теме: «Обмен белков». Контрольная работа.

16 неделя. Коллоквиум по Модулю 3 «Обмен липидов. Обмен простых белков».

17 неделя. Итоговое занятие.

Правила пользования приборами для биохимических исследований

В биохимических исследованиях фотометр используется для определения концентрации вещества в растворе по оптической плотности или коэффициенту пропускания раствора. Действие фотометра основано на том, что многие химические соединения поглощают свет в определенной спектральной области. При этом в определенных пределах концентраций величина оптической плотности раствора (то есть интенсивность поглощения света) прямо зависит от концентрации вещества в растворе. Оптическая плотность раствора определяется по формуле:

D = E l • c

D – оптическая плотность

E – коэффициент молярной экстинкции

l – толщина кюветы

c – концентрация раствора

E – коэффициент молярной экстинкции (или молярный коэффициент поглощения) – это оптическая плотность раствора концентрацией 1 моль/л при длине светового пути (толщине кюветы) равной 1 см. Величина постоянная для каждого вещества при данной длине волны.

1 – ручка изменения длины волны излучения

2 – световое табло

3 – панель управления

4 – крышка кюветного отделения

5 – ручка перемещения кювет

6 – тумблер «Сеть»

7 – выбор режима измерения оптической плотности

8 – градуировка

9 – результаты измерения оптической плотности холостой пробы (воды)

10 – результаты измерения оптической плотности исследуемого раствора

11 – кювета (внешний вид)

1. Включите прибор в сеть. При закрытой крышке кюветного отделения включите тумблер «Сеть» (6), расположенный на боковой поверхности прибора. Тумблер загорится красным светом. В нижней половине светового табло (2) сначала появится надпись «Прогрев прибора», затем надпись «Прогрев лампы». По истечении 10 мин фотометр выдаст звуковой сигнал и на табло появится надпись «Готов к работе. Введите режим».

2. Последовательным нажатием клавиши D на панели управления (3) выберите нужный режим измерения (А – оптическая плотность), который высветится в нижней части светового табло (7).

3. Установите нужную длину волны круглой ручкой (1), находящейся слева на передней панели прибора (значение длины волны высвечивается в верхней строке светового табло). Установку длины волны необходимо выполнять подводкой со стороны коротких волн к более длинным. Если при установке значение длины волны превысило требуемое, необходимо вновь вернуться на 20–30 нм к более коротким волнам и повторно аккуратно подвести к требуемому значению длины волны.

4. Промойте водой кюветы (11) и промокните их внутреннюю поверхность чистой фильтровальной бумагой. Снаружи также протрите их фильтровальной бумагой. Откройте крышку кюветного отделения (4). Налейте в кювету воду и установите ее строго вертикально в дальнее гнездо кюветодержателя. Исследуемый раствор налейте во вторую кювету и установите ее в ближнее гнездо кюветодержателя. При установке кювет нельзя касаться их рабочих поверхностей. Наличие загрязнений на рабочих поверхностях может привести к неверным результатам.

5. Ручку перемещения кювет (5) установите в крайнее левое положение.

6. Закройте крышку кюветного отделения.

7. Нажмите клавишу «#» на панели управления. В нижней части светового табло на верхней строке появится надпись «Градуировка» (8), а через 3–5 секунд надпись «Измерение». На нижней строке появится измеренное значение оптической плотности холостой пробы (воды), например «А = 0,000» (9). Оно должно составлять 0,000±0,002. Если значение А имеет большее отклонение от нуля, необходимо повторно провести градуировку (нажать «#»).

8. Ручку перемещения кювет установите вправо до упора. Через несколько секунд на нижней строке появится значение оптической плотности исследуемого раствора, например «А = 0,230» (10). Запишите полученное значение оптической плотности в рабочую тетрадь.

9. После завершения работы выключите прибор нажатием тумблера «Сеть» и отключите прибор из сети.

Термоблок предназначен для нагревания проб в пробирках и виалах в заданном температурном режиме.

ВАЖНО: прибор работает без заполнения ячеек водой. Заполнение водой опасно для жизни!

Термоблок ПЭ-4020. Общий вид.

1 – тумблер «Сеть»

2 – кнопка «Установка/работа»

3 – кнопки установки температуры

4 – ячейки для пробирок

5 – световое табло

6 – световой индикатор работы

1. Включите тумблер «Сеть» (1). Тумблер загорится красным светом.

2. Используя кнопки установки температуры (3) выставите на световом табло (5) требуемый температурный режим.

3. Нажмите кнопку «Установка/работа» (2). После этого начнется нагрев ячеек. Световой индикатор работы (6) станет мигать красно-зеленым цветом, а на световом табло высветится текущая температура в ячейках, которая будет постепенно увеличиваться, пока не достигнет заданного значения. После этого термоблок будет работать в режиме поддержания заданной температуры.

4. После достижения заданной температуры установите пробирки с исследуемыми растворами в ячейки термоблока (4) и оставьте их в течение необходимого срока инкубации.

5. После завершения работы выключите прибор нажатием тумблера «Сеть» и отключите прибор из сети.

Правила пользования автоматической пипеткой переменного объема

1. Объем дозирования отображается на цифровом дисплее на рукоятке пипетки (рис. 1).

2. Требуемый объем устанавливается вращением операционной кнопки, расположенной наверху пипетки (рис. 2). Чтобы увеличить объем дозирования, поверните операционную кнопку против часовой стрелки, чтобы уменьшить объем – по часовой стрелке.

3. Убедитесь, что цифры, показывающие объем дозирования, целиком видны в окне дисплея и установлены до щелчка.

4. Запрещается устанавливать объем, выходящий за границы диапазона дозирования пипетки. Прилагая чрезмерное усилие при выкручивании операционной кнопки за пределы диапазона дозирования, Вы можете сломать детали внутреннего механизма, что приведет к поломке пипетки.

ТЕХНИКА ПИПЕТИРОВАНИЯ

А – исходное положение

В – первая остановка

С – вторая остановка

1. Нажмите на операционную кнопку до первой остановки (В). 2. Погрузите наконечник в раствор примерно на глубину 1 см и плавно отпустите кнопку (А).

3. Извлеките наконечник, аккуратно снимая излишки раствора о край резервуара.

4. Выпустите взятый раствор, плавно нажимая на кнопку до первой остановки (В). После примерно секундной паузы нажмите операционную кнопку до второй остановки (С). После выполнения данной операции наконечник должен полнocтью опустошиться.

5. Отпустите кнопку в исходное положение, если необходимо, смените наконечник и продолжайте пипетирование.

Всегда нажимайте и отпускайте операционную кнопку плавно.

Упор на пипетке должен опираться на указательный палец. При работе ВСЕГДА удерживайте пипетку в строго вертикальном положении!

Раздел 1. Простые и сложные белки. Нуклеиновые кислоты. Ферменты, коферменты, витамины

1.1. Семинар «Химия белков, аминокислоты»

Белки – это высокомолекулярные соединения, молекулы которых построены из остатков аминокислот, составляют основу структурных элементов клеток и тканей, а также выполняют многообразные жизненно важные функции (транспортные, защитные, регуляторные, каталитические), обусловленные способностью за счет своей уникальной пространственной структуры распознавать другие молекулы и взаимодействовать с ними.

Аминокислоты в молекуле белка соединены между собой пептидными связями (-CO-NH-), образуя полипептидные цепи. Пептидная связь возникает между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой аминокислоты, при этом отщепляется молекула воды.

Аминокислоты, кодируемые генетическим кодом и включающиеся в процессе трансляции в белки, называют протеиногенными. В основу современной классификации аминокислот положено химическое строение их радикалов. Каждая аминокислота имеет не только своё название (тривиальное и химическое), но и принятое трехбуквенное сокращение, а также латинский однобуквенный символ.

Следует отметить, что аминокислоты являются не только структурными элементами пептидов и белков, но и входят в состав других природных соединений (коферментов, конъюгированных желчных кислот, антибиотиков). Некоторые аминокислоты являются предшественниками биологически активных веществ (гормонов, биогенных аминов) или важнейшими метаболитами (глюконеогенез, биосинтез и деградация протеиногенных аминокислот, цикл мочевинообразования).

Аминокислоты традиционно делятся на заменимые и незаменимые в зависимости от возможности их синтеза в организме животного. Для большинства моногастричных (нежвачных) животных незаменимыми являются 8 аминокислот: валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и фенилаланин, для растущего организма детенышей к незаменимым относят также аргинин и гистидин. Жвачные животные получают незаменимые аминокислоты преимущественно за счет бактериального белка, синтезируемого в рубце.

Незаменимые аминокислоты для человека и некоторых видов животных

В белках различают несколько уровней структурной организации: первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Первичная структура определяется числом и последовательностью аминокислотных остатков, соединённых между собой пептидными связями. Вторичная структура возникает за счёт образования водородных связей между группами >N-H и O=C< данной полипептидной цепи, что приводит к упорядоченному расположению отдельных участков полипептидной цепи в виде α-спиральной или β-складчатой структуры. Третичная структура белков образуется за счёт взаимодействия радикалов аминокислот (водородные связи, ионные связи, дисульфидные мостики, гидрофобные взаимодействия). Четвертичная структура некоторых белков образуется при взаимодействии отдельных полипептидных цепей, обладающих вторичной и третичной структурой.

Белки условно делят на простые (при гидролизе образуют смесь аминокислот) и сложные, или конъюгированные (состоят из белкового и небелкового компонентов). В качестве небелковой части (простетической группы) конъюгированных белков могут выступать нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, металлы, пигменты, а также фосфорная кислота и коферменты, что находит отражение в классификации данной группы биологических соединений:

• хромопротеины

• нуклеопротеины

• липопротеины

• фосфопротеины

• гликопротеины

• металлопротеины

Хромопротеины содержат окрашенную простетическую группу, например, красные белки – гемопротеины (гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза, пероксидаза), желтые белки – флавопротеины (ферменты класса оксидоредуктаз, содержащие производные рибофлавина).

Нуклеопротеины в качестве простетической группы содержат ДНК или РНК, что объясняет их участие в экспрессии генов и биосинтезе белка.

Липопротеины содержат такие липиды как триацилглицеролы, свободные жирные кислоты, эфиры холестерина, фосфолипиды и отличаются друг от друга процентным содержанием белка и плотностью. Липопротеины встречаются как в свободном виде (ЛП плазмы крови), так и в структурированном (в составе клеточных и внутриклеточных биомембран).