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Cyclisches AMP aktiviert Proteinkinasen A (PKAs) und das „Exchange Protein Directly Activated by cAMP“ (EPAC). Zusätzlich kann es direkt „Cyclic Nucleotide-Gated ion channels” (CNG)-Kanäle aktivieren und dadurch einen depolarisierenden Ca2+-Einstrom aus dem Extrazellularraum einleiten [183]. Typische Zielstrukturen, die durch PKAs phosphoryliert werden, sind Rezeptoren, Ionenkanäle, Transkriptionsfaktoren wie CREB (s. 3.2.3), Phosphodiesterasen, Calmodulin-abhängige Kinasen (CaMK) [184], Ionenpumpen und diverse Stoffwechselenzyme [185: S. 411 ff., 186: S. 10 2. Absatz]. EPAC reguliert u.a. Integrinexpression und Exozytose [187] und ist an Prozessen der Zelldifferenzierung, Proliferation, Apoptose und Genexpression beteiligt [188: S. 18, 189].
3.2.2 ßAR –Regulierung
Eine regelkreisartige Modulierung der ß-adrenergen Rezeptoren verhindert eine Dauerreizung und übermäßige AC9-Aktivierung. ßAR werden bei hohem intrazellulärem cAMP-Gehalt durch PKAs [190] und u.a. durch Proteinkinase C (PKC) [191] phosphoryliert und desensitisiert. Diese Rezeptor-Phosphorylierung ist unspezifisch und als Nebenprodukt einer induzierten Phosphorylierungsaktivität der Proteinkinasen anzusehen (heterologe Desensitisierung), die auch durch TNFα und IL-1ß ausgelöst werden kann [192-194].
ßAR können jedoch auch durch eine spezifisch ß-adrenerge Rezeptorkinase (BARK)3 desensitisiert werden (homologe Desensitisierung). BARKs werden zunächst durch eine PKA aktiviert und erhöhen dann durch Phosphorylierung des ß-Rezeptors dessen Affinität für eine weitere Klasse von Proteinen, den Arrestinen (ß-Arrestinen). Durch die Bindung von ß-Arrestin an den phosphorylierten Rezeptor kommt es zur Entkopplung des Rezeptors von dem gebundenen und aktivierten G-Protein und dadurch zu seiner Inaktivierung [196, 197]4. Die Phosphorylierung des Rezeptors durch die BARK erfolgt sehr rasch (< 2 Minuten) und ist in manchen Fällen persistent [171: S. 82 2. Absatz, 180: S. 6]. Die an ßAR gebundenen, desensitisierenden Phosphatreste werden kontinuierlich durch unspezifische Phosphatasen abgebaut, und die Aktivierbarkeit der Rezeptoren wird damit wiederhergestellt.
Eine anhaltende Rezeptoraktivierung führt bei ßAR zu einer vorübergehenden Reduktion der Rezeptorexpression (Downregulation) [198]. Diese Downregulation erfolgt durch endozytotische Internalisierung der Rezeptoren, kann aber auch durch eine direkte Rezeptor-Degradation in der Plasmamembran [199] bewirkt werden.
3.2.3 cAMP-abhängige Genexpression
cAMP kann die Expression von Genen regulieren, die innerhalb ihres Promotors eine bestimmte Gensequenz, das „cAMP-Response-Element“ (CREs), tragen. An diese CREs binden die sogenannten „cAMP-Responsive-Element-Binding-Proteins“ (CREBs). Das sind Transkriptionsfaktoren, die durch aktivierte PKAs, aber auch durch andere Proteinkinasen wie z.B. Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaM-Kinase II) oder Mitogen-Activated Protein-(MAP)-Kinase aktiviert und reguliert werden. Vereinfachend kann man sagen, dass die Transkription eines CREB-regulierten Gens durch Anlagerung von aktiviertem CREB an CRE gestartet wird, wenn zusätzlich ein Coaktivator, das „CREB-binding Protein“ CBP, die Verbindung zwischen CREB und dem Transkriptionsstartpunkt herstellt. CREBs bilden einen zentralen Zugang zur Genexpression, der von sehr unterschiedlichen, extrazellulären Liganden und intrazellulären Signalwegen genutzt werden kann [200, 201]. U.a. induzieren ß2AR ihre eigene Synthese über den cAMP/CREB-Weg [202, 203].
3.2.4 cAMP-Quellen/ Zytosolischer cAMP-Spiegel
Der cAMP-Spiegel wird nicht nur durch ßAR-Stimulation, sondern auch durch Stimulation anderer Gs-Protein gekoppelter Rezeptoren intrazellulär erhöht: z.B. durch Dopamin (am D1R), Serotonin (am 5-HT4R, 5-HT6R und 5-HT7R, die im ZNS, PNS und GI vorkommen), Histamin (am H2R, der besonders auf Parietalzellen der Magenschleimhaut vorkommt), Prostaglandin E2 (am EP2-R und EP4-R), Prostaglandin D2 (am DP1-R) [204: S. 14-15], Glukagon, Adenosin (am A2AR- und A2BR) [205: S. 56, 206], Adrenocorticotropes Hormon (ACTH) [207], Parathormon (PTH) am PTH-R [208: S. 7-8], Duftstoffe an olfaktorischen Rezeptoren (OR) [209: S. 8-9], die Inkretine „Glucoseabhängiges insulinotropes Peptid“ (GIP) und „Glucagon-like-Peptid“ (GLP-1) [210: S. 11-13] etc., oder Rezeptor unabhängig durch Substanzen wie Forskolin [171: S. 14 Zeile 4].
Hervorzuheben ist, dass ßAR vor allen sonstigen, das AC/cAMP-System anstoßenden Rezeptoren, das mit Abstand höchste Triggerpotential für das AC/cAMP-System haben [62: S. 10 unten]. Es scheint daher berechtigt, ßAR als die wesentliche, zelluläre „cAMP-Quelle“ zu bezeichnen, auch wenn abhängig von der Organ- und Zellspezifität andere Gs-Protein koppelnde Rezeptoren wichtige Beiträge zur cAMP-Versorgung der Zellen leisten.
Zelluläres cAMP hat eine kurze Halbwertzeit von nur wenigen Sekunden bis Minuten [174: S. 9], da es ständig durch cAMP-selektive Phosphodiesterasen (PDE4, -7, -8) oder gemischtspezifische Phosphodiesterasen (PDE1, -2, -3, -10, -11), die cAMP und cGMP als Substrat haben, aufgespalten und inaktiviert wird [211]. Besonders schnell wird der zelluläre cAMP-Spiegel durch PDE2 gesenkt, deren cAMP-Hydrolysekapazität die cAMP-Synthesekapazität der ACs übersteigt [187]. Allgemein nimmt der cAMP-Abbau zu, wenn der zellulären cGMP-Gehalt sinkt: ein reduziertes cGMP-Substratangebot führt zu einem vermehrten cAMP-Abbau durch gemischtspezifische PDE.
Eine Anhebung des zytosolischen cAMP-Spiegels kann durch Aktivierung der ACs oder Hemmung von cAMP-abhängigen/gemischtspezifischen PDEs erreicht werden; umgekehrt führt eine Hemmung der ACs oder Induktion von PDEs zu einer cAMP-Spiegel Absenkung und zum Abbruch cAMP-abhängiger Prozesse.
Abbildung 4: Veränderung des zytosolischen cAMP-Spiegels durch abbauende und zuführende Prozesse
3.2.5 Calcium-Regulation durch ßAR
Bei ß1AR-Stimulation am Herzen halten aktivierte PKAs spannungsabhängige Calciumkanäle länger offen, bewirken einen verstärkten Calcium-Einstrom aus dem Extrazellulärraum und fördern anschließend die Herzmuskelerschlaffung durch einen forcierten Calcium-Abfluss in das SR oder nach extrazellulär [212]. ß2AR senken an der glatten Muskulatur das freie intrazelluläre Calcium durch eine verstärkte Ca2+-Aufnahme in das sarkoplasmatische Retikulum (SR) [213, 214] und erreichen dadurch eine Relaxation.
Die zentrale Aufgabe der ßAR im Rahmen der zytosolischen Calciumregulation besteht in der Rückführung von zytosolischem Ca2+ in die zellulären Ca2+-Speicher des SR oder ER, wodurch eine Beendigung Ca2+-abhängiger Prozesse erreicht und die Voraussetzung für erneut einsetzende, Calcium abhängige Leistungen geschaffen wird [215].
Die Rückführung zytosolischen Calciums in die Speicher von SR und endoplasmatisches Retikulum (ER) wird von einer hoch effektiven Ca2+-ATPase der „Sarko/endoplasmatisches Retikulum Ca2+-ATPase“ (SERCA) geleistet5. SERCA wird durch Bindung an Phospholamban (PLB) gehemmt. Eine SERCA-Aktivierung bedarf der Enthemmung, die durch eine cAMP/PKA-abhängige Phosphorylierung von PLB erreicht wird [216]. Die Rückführung zytosolischer Ca2+-Ionen in das SR/ER ist cAMP/PKA-vermittelt und damit stark unter ßAR-Einfluss.
3.2.6 Wirkungen von ß2AR/cAMP auf IκB und NF-κB
Zahlreiche Forschungsarbeiten belegen, dass ß2AR-Stimulation oder ansteigende zelluläre cAMP-Spiegel über PKA/CREB die Transkriptionsaktivität des nukleären Faktors NF-κB blockieren [217-220].
Spannende Forschungsergebnisse gibt es auch zur Auswirkung von cAMP auf das zelluläre IκBα-Level, das auf mindestens drei Wegen durch cAMP angehoben werden kann.
1 P. Farmer und J. Pugin (2000) konnten für Monozyten zeigen, dass Noradrenalin, Forskolin, PGE2 (Iloprost) und andere Gs-Rezeptor koppelnde Liganden eindeutig über cAMP die Aktivität des IκBα-Promotors und nachfolgend die IκBα-Expression steigern, und dadurch das IκBα-Protein-Level sowohl zytosolisch als auch nukleär signifikant anheben [221]. Entsprechendes konnten V. Gavrilyuk, D. L. Feinstein et al. (2005) für Astrozyten und deren IκBα-Expression belegen [222].
2 M. Neumann et al. (1995) haben nachgewiesen, dass in T-Lymphozyten steigende cAMP-Spiegel über PKA-Effekte das zytosolische IκBα-Level durch Inhibition der Degradation anheben [223].
3 Die Ergebnisse von G. Hong et al. (2010) weisen in dieselbe Richtung: ihren Forschungen entsprechend wird die IL-1ß/IFNγ induzierte Aktivierung von NF-κB in Hepatozyten durch inhibitorische Effekte von cAMP auf IKK und die IκB-Phosphorylierung verhindert. Diese cAMP-Effekte sind jedoch PKA unabhängig [224]. A. Kim et al. (2009) haben egänzend gezeigt, dass auch in Melanomzellen ein erhöhter cAMP-Spiegel die Aktivierung von NF-κB inhibiert [220].
Wie für Monozyten, T-Zellen, Astrozyten, Hepatozyten und Melanomzellen nachgewiesen, hebt ß2AR-Stimulation bzw. ein erhöhter zellulärer cAMP-Spiegel das zelluläre IκB- bzw. IκBα -Level an. Obwohl zurzeit noch keine expliziten Informationen über den Einfluss von cAMP auf den IκB-Gehalt von KC zu erhalten sind, kann folgendes festgehalten werden: steigende zytosolische cAMP-Spiegel unterdrücken NF-κB induzierter Genexpression (s.o.), und vermitteln so die antiinflammatorischen Wirkungen der ß2AR (s. 4.12, 4.14.1), [225]. Bei einem cAMP-Mangel fehlt nicht nur die PKA/CREB-abhängige Blockade der Transkriptionsaktivität von NF-κB, sondern es fallen auch die das IκB-Level anhebenden Wirkungen von cAMP flach. Daher ergibt sich folgende, für o.g. Zelltypen gesicherte, Aussage:
Ein hoher zytosolischer cAMP-Gehalt blockiert NF-κB abhängige Genexpression, hebt das zelluläre IκB-Level und vermindert aktives NF-κB. Umgekehrt führt ein zytosolischer cAMP-Mangel zur Enthemmung von NF-κB und zu einer vermehrten Expression NF-κB-abhängiger Zellprodukte.
3.2.7 Escape-Mechanismen der ß2AR
Bei chronischer Überstimulierung von ßAR, wie z.B. unter einer ß-Mimetika-Therapie bei Asthma bronchiale oder COPD, können ß2AR (aber nicht ß1AR) an hemmende Gi-Proteine koppeln, und so zur Reduktion von cAMP und zur Schwächung katecholaminerger Wirkungen führen [226]. ß2AR können unter bestimmten Ausnahmebedingungen auch an Gq-Proteine koppeln [227].
3.3 α-Adrenozeptoren (αAR):
αAR sind wie ßAR membranständige GPCR und kommen in den Subtypen α1 und α2 vor. α1AR sind besonders im Zentralnervensystem und an der glatten Muskulatur von Gefäßen und im Urogenitaltrakt vertreten, wo sie über die Kontraktion glatter Muskulatur zur Blutdruckerhöhung und ggf. zum Harnverhalt führen, während α2AR sich im zentralen und peripheren Nervensystem finden und dort präsynaptisch die Freisetzung von Neurotransmittern hemmen.
3.3.1 Signalübertragung der α1AR
α1AR koppeln an Gq-Proteine, die ihre Impulse über Phospholipase C (PLC), Inositoltrisphosphat (IP3), Diacylglycerin (DAG), Ca2+ und Phosphokinase C (PKC) weiterleiten, wobei die PLC in einem ersten Schritt zur Bildung von IP3 und DAG aus membrangebundenem Phosphatidylinositolbisphosphat (PIP2) führt. IP3 bindet darauf an seinen Rezeptor (IP3R), der sich auf den Membranen intrazellulärer Ca2+-Speicher wie ER und SR befindet und löst dort eine Ca2+-Freisetzung in das Zytosol aus. DAG und Ca2+ aktivieren zusammen die PKC, die ihrerseits zahlreiche Stoffwechselleistungen durch Phosphorylierung ermöglicht oder unterbindet. U.a. inhibiert die PKC die AC9 und damit die cAMP-Synthese [182].
3.3.2 Calcium-Regulation durch Gq-Protein gekoppelte Rezeptoren
Gq-Protein Aktivierung ist regelmäßig von einer Ca2+-Mobilisierung aus intrazellulären Speichern wie ER oder SR begleitet. Dabei kommt es, abhängig von dem Füllungszustand der Calciumspeicher, zur Aktivierung von Zellmembran ständigen “store-operated calcium channels“ (SOCC) [228], die einen Ca2+-Auffüllungsstrom aus dem Extrazellulärraum zur Regeneration der intrazellulären Ca2+-Speicher auslösen [229]. Zusätzlich zu diesem „Store operated Ca2+-Entry“ (SOCE) können Gq-gekoppelte Rezeptoren über Aktivierung der PLC zu einem „Receptor operated Ca2+-Entry“ (ROCE) führen. Während der zytosolischen Ca2+-Erhöhung lagern sich Ca2+-Ionen an intrazelluläre Ca2+-bindende Proteine wie z.B. Calcineurin oder Calmodulin (CaM) an und aktivieren diese. Aktiviertes CaM kann u.a. ACs (außer der AC9), die lösliche Guanylatzyklase (sGC), Proteinkinasen und auch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) aktivieren [230].
3.3.3 Signalübertragung der α2AR
α2AR koppeln an Gi/0-Proteine, die eine Hemmung von Adenylatzyklasen bewirken und damit zu einer Senkung des cAMP-Spiegels und einer Blockade cAMP-abhängiger Wirkungen führen.
3.4 Cholinerge Rezeptoren (AChR)
Cholinerge Rezeptoren sind membranständige, durch ACh erregbare Rezeptoren, die als nikotinische (nAChR) oder muskarinische (mAChR) Rezeptoren vorliegen.
3.4.1 Nikotinische Rezeptoren
Nikotinische Rezeptoren (nAChR) finden sich insbesondere auf der neuromuskulären Endplatte, wo sie zu einer extrem schnellen Signalübertragung vom motorischen Nerven auf die angesteuerte Muskulatur führen. nAChR finden sich u.a. auch in den vegetativen Ganglien auf der Postsynapse des zweiten Neurons, auf KC (3.1), Immunzellen [231], EC [232] und, wie Kurzen (2004) zeigen konnte, auf den Schweiß produzierenden Azinuszellen der Schweißdrüsen [233: S. 455]. Die nAChR gehören zu den Liganden gesteuerten Ionenkanälen, sind also Rezeptor und Ionenkanal in einem. Ihre Kanalröhrchen werden aus fünf Einheiten (Pentamere) gebildet, welche jeweils Kombinationen aus gleichen oder verschiedenen Untereinheiten sind [234: S. 6]. Die Untereinheiten haben unterschiedliche Funktion und kommen als α-, ß-, γ- und δ-Formation vor, wobei die α-Formation, die in den Typen α1 bis α10 vorliegt, die ACh-Bindung des Rezeptors vermittelt. Jedes Pentamer muss mindestens zwei α-Untereinheiten besitzen, um ACh binden zu können. Die Aktivierung der nAChR führt über eine Konformationsänderung zur vermehrten Durchlässigkeit des Rezeptors für bestimmte Kationen (Na+, Ca2+, K+). Homopentamere werden aus fünf α7- oder α9-Einheiten gebildet [233] und sind hauptsächlich für Ca2+ durchlässig [235], während Heteropentamere aus verschiedenen Einheiten gebildet werden und unterschiedliche Leitfähigkeiten besitzen. nAChR führen durch Kationen-Einstrom unmittelbar zu einer Depolarisation der Zellmembran, der eine Aktivierung spannungsabhängiger Ca2+Kanäle (VOCs) mit forciertem Calciumioneneinstrom folgen kann [235]. In der gesunden Epidermis werden im Stratum basale α9-nAChR und im Stratum granulosum α7-nAChR exprimiert [233: S. 454].
Besonderheit: α9-nAChR sind durch ACh und Cholin, α7-nAChR durch ACh, Cholin und Muskarin stimulierbar [233: S. 456, 236, 237]. Atropin, besonders als Blocker muskarinischer Rezeptoren bekannt, blockiert cholinerge Rezeptoren mit folgender, absteigender Effektivität: mAChR > α9-nAChR > α7-nAChR > α3ß-nAChR [238].
Die nAChR kommen in drei Funktionszuständen vor: erregt&geöffnet, geschlossen&desensitisiert, geschlossen&erregbar. Diese Funktionszustände werden nacheinander durchlaufen, wobei Phosphorylierungen am Rezeptor zu einer beschleunigten Desensitisierung führen [234: S. 9-10]. Die Sensitivität von nAChR wird u.a. durch cAMP/PKA-Aktivität reguliert [239: S. 430, 240: S. 6 unten].
3.4.2 Muskarinische Rezeptoren
Muskarinische Rezeptoren (mAChR) sind GPCR, kommen in den Subtypen M1-M5 vor und werden in weiten Bereichen des Körpers direkt von parasympathischen Neuronen angesteuert. M1 ist der neuronale Typ und tritt besonders im Gehirn und ganglionär auf, M2 findet sich am Herzen und vermittelt dort die Vaguseffekte, M3 ist besonders auf glatter Muskulatur, Endothel, Drüsenzellen, Schweißdrüsen und den Belegzellen des Magens lokalisiert und führt u.a. zur Vasodilatation durch NO-Bildung oder zur Salzsäureproduktion im Magen. Über M4 und M5 ist bekannt, dass sie hauptsächlich im ZNS vorkommen; aber ihre physiologische Bedeutung ist noch weitgehend unklar [241: S. 572]. KC können alle Subtypen der M1-M5 mAChR exprimieren [159: S. 169, 242], wobei basale KC der gesunden Epidermis besonders M2, M3 und M4 und suprabasale M1 und M4 exprimieren [159, 160, 243]. Eine Aktivierung von mAChR der KC kann Einfluss auf deren Migrationsgeschwindigkeit, Apoptose, Zell-Zellkontakte und Proliferation nehmen [157].
Die Subtypen M1, M3, M5 sind wie 1AR Gq-Protein gekoppelt und führen zu zytosolischer Ca2+-Erhöhung aus dem ER oder SR und zur Aktivierung von CaM (s.3.3.2). Die Subtypen M2 und M4 sind wie α2AR an inhibitorische Gi-Proteine gekoppelt, führen zur Öffnung von membranständigen, hyperpolarisierenden Kaliumkanälen und einer Hemmung der Adenylatzyklase [244, 245].
Besonderheit: Der M3 ist nicht nur durch ACh, sondern auch durch Cholin stimulierbar [67: 3. Absatz].
3.5 Interaktionen adrenerger und cholinerger Rezeptorwirkungen
KC und Immunzellen, exprimieren in jeder Reifungsphase charakteristische cholinerge/ adrenerge Rezeptor-Kombinationen (s. 3.1), über die gemeinsam und durch gegenseitige Regulation physiologische Effekte erzielt werden. Im Folgenden werden kurz die bestehenden Modulationsmöglichkeiten ß-adrenerger Stimulation durch αAR, mAChR und 7-,9-nAChR beschrieben.
α2AR, M2, M4 hemmen über Gi-Proteine Adenylatzyklasen und sind damit direkte Antagonisten der ßAR vermittelten cAMP-Synthese. Sie senken den zellulären cAMP-Spiegel.
α1AR, M1, M3, M5 dämpfen in der Regel ßAR-Wirkungen, da sie als Gq-Protein gekoppelte Rezeptoren zu einer Hemmung der AC9 und heterologen Desensitisierung von ßAR führen können. (s. 3.2.1, 3.2.2). Bzgl. der zellulären Ca2+-Regulation wirken o.g. Rezeptoren fallweise gegenläufig zu ß2AR: während jede Stimulierung Gq-Protein gekoppelter Rezeptoren zu einer Erhöhung der Cai führt, bewirkt ß2AR-Stimulation häufig (z.B. im Rahmen von Muskelrelaxation) ein Absinken der Cai [246]. α1AR antagonisieren regelmäßig ß2AR-Wirkungen, wie z.B. bei der Gefäßtonusregulation, Lipolyse und Insulinfreisetzung (s. 5.). Mit Ausnahme des endothelialen M3-Rezeptors, der am Endothel die NO-Synthese stimuliert und dadurch den vaskulären cAMP-Spiegel anheben kann (s. 5.1.1), senken o.g. Rezeptoren tendentiell den zellulären cAMP-Spiegel.
7-,9-nAChR sind Ca2+-Kanäle, deren Expression [247, 248, 249: S. 83] und Sensitivität unter dem Einfluss von cAMP/PKA steht [239: S. 430]. Der durch sie verursachte Ca2+-Einstrom kann über CaM membranständige Adenylatcyclasen (außer der AC9) aktivieren. Als Beispiel sei die Adenylatcyclase1 (AC1) genannt, die in Nervenzellen durch α7-nAChR aktiviert wird [250]. nAChR-Stimulation kann ferner eine extrazelluläre Adenosin-Akkumulation bewirken, durch die ein Adenosin A2-Rezeptor vermittelter Anstieg des intrazellulären cAMP-Levels stattfindet [251, 252]. nAChR unterstützen die zelluläre cAMP-Synthese.
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