Высокодисперсные коллоидные системы и меланины чаги

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

АОА – антиоксидантная активность

АОЕ – антиоксидантная ёмкость

атм. – атмосфера

БАД – биологически активная добавка

БАВ – биологически активное вещество

БХ – бумажная хроматография

ВЖК- высшие жирные кислоты

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЖХ – газожидкостная хроматография

ГФ – Государственная фармакопея

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ИК-спектроскопия – инфракрасная спектроскопия

ИК-спектр – спектр, снятый в инфракрасной области спектра

ККМ – критическая концентрация мицеллообразования

КЧ – культивируемая чага

МП – экстракция, с применением механического перемешивания

ОДЭФ – гидроксиэтилендифосфоновая кислота

ПФК – полифенолоксикарбоновый комплекс

ПМЦ – парамагнитный центр

ПЧ – природная чага

РЕМ – ремацерация

РЕП – реперколяция

ССИ – спад свободной индукции

СЭ – сухой экстракт

Трилон Б – натриевая соль этилендиамин-N,N,N1,N1-тетрауксусной кислоты

т. пл. – температура плавления

ТСХ – тонкослойная хроматография

УФ-спектр – спектр, снятый в ультрафиолетовой области спектра

ФКС – фотонная корреляционная спектроскопия

ФК – фенолкарбоновые кислоты

Ф – фенолы

ЭПР – электронный парамагнитный резонанс

ЯМР – ядерный магнитный резонанс

AFM – атомно-силовая сканирующая электронная микроскопия

ABTS – 2,2’-азинобис-3-этилбензотазолин-6-сульфоновая кислота

DHI – 5,6-дигидроксииндол

DHICA – 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновой кислоты

DHN – 1,8-дигидроксинафталин

DPPH – 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил

FB часть чаги – плодовое тело гриба (fruiting body)

LD50 – величина средней дозы, после поступления которой в организм животных в течение трех суток наступает гибель 50 % подопытных животных

L-ДОФА – дофамин, 2-(3,4-дигидроксифенилэтиламин))

MALDI – масс спектрометрия

n – количество данных, взятых для статистической обработки

SEM – сканирующая электронная микроскопия

STM – сканирующая тоннельная микроскопия

ST часть чаги – плотная часть (sclerotium)

SAXS – малое угловое рентгеновское рассеивание

ТМ-AFM – полуконтактный режим атомной силовой микроскопии

WAXS – широкий угловой рентген, рассеивающий

ВВЕДЕНИЕ

В монографии систематизирован материал по исследованию и применению гриба Inonotus obliquus (Fr.) Pil (чаги), который широко применяется в народной и официнальной медицине России, стран Дальневосточного региона, Северной Америки и Европы. Представлены обзор и анализ существующих и перспективных методов получения водных извлечений чаги, способов исследования этой коллоидной системы и её дисперсной фазы – полифенолоксикарбонового комплекса – хромогенного комплекса – меланина; проанализирована глубина исследования биологически активных веществ в водном извлечении чаги и в меланине; приведен спектр физиологической активности препаратов на основе чаги; показана возможность использования химических, физических и биотехнологических методов реструктуризации коллоидной системы водного извлечения чаги для расширения теоретических представлений о её структуре и получения практических результатов. На основе обзора современных литературных данных, используя широкий спектр исследований меланина чаги и принцип универсальности построения биологических объектов, развиты теоретические представления об их структурной организации.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту №_01201252915 от 28.02.2012 г., тема: "Разработка биологически активных добавок на основе супрамолекулярных бионаносистем".

Исторические аспекты исследования полидисперсных коллоидных систем и меланина гриба чаги

К чаге как природному объекту, способному обеспечить безопасность жизнедеятельности организма человека, исследователи обращались в трудные времена. Основные прорывы в изучении её действующих компонентов, физиологической и терапевтической активности, связаны с окончанием второй мировой войны и аварией на Чернобыльской атомной станции.

Начатые в пятидесятые годы в Ленинграде исследования чаги были направлены на изучение биологии чаги, образование в ней физиологически активных веществ в природных условиях и при выращивании в культуре, а также на поиск методов выделения и очистки лечебных веществ чаги с целью их всестороннего химического и биохимического исследования. Кроме того, были разработаны и внедрены в производство ряд препаратов на основе водных извлечений чаги. Они были протестированы на ряде биологических объектов, в том числе накоплен большой материал при лечении ими людей, больных неоперабельным раком различной этиологии [1]. Огромный вклад в изучении чаги был внесен большим коллективом представителей трёх структур – учёными Ботанического института им. В.Т.Комарова, медиками I Ленинградского медицинского института им. И.П. Павлова и технологами Ленинградского химико-фармацевтического завода № 1. Химический состав и биосинтетическую деятельность гриба изучали П.А. Якимов, А.Н. Шиврина, Е.В. Ловягина, О. П. Низковская, С.М. Андреева, Г.А. Кузнецова, Е.Г. Платонова с соавторами. Действие биологически активных веществ чаги на организм исследовали, а также проводили клинические испытания препаратов из чаги П.К. Булатов, М.П. Березина, Е.Я. Мартынова, М.В. Еременко, Н.Л. Маттисон и ряд других исследователей. В этот же период польские учёные выделяют и идентифицируют терпены из чаги [2,3], Я. Краусс Жаки [4] и С. Пясковский [5] применяют водные экстракты чаги для лечения рака, Тейлор в США – для лечения аденокарциномы [6].

Вторым этапом изучения чаги стали работы девяностых годов прошлого века. Г.Л. Рыжова с соавторами разработала способ получения препарата на основе водного извлечения чаги с использованием в экстракции ультразвука. Этими исследователями проведена большая работа по изучению состава нового препарата и его физиологического действия [7,8]. В работе Е.А. Калашниковой (Пятигорская фармацевтическая академия) проведено изучение сырья чаги, препарата «Бефунгин», водных извлечений чаги, полифенооксикарбонового комплекса и фильтрата, остающегося после его выделения хлористоводородной кислотой. [9] В это же время учёные из Белоруссии исследуют меланины, которые выделяют из водных извлечений чаги. [10,11] K. Kahlos (Финляндия) исследует терпены чаги, их структуру и физиологическую активность. [12-14] Ряд авторов из Польши публикует сообщения о меланинах, выделенных из водного извлечения чаги. Они также изучают механизм влияния водных извлечений чаги на раковые клетки и ферментативную активность каталазы. [15-18].

С конца XX века учёные Японии и Китая, а также ряд ученых других стран проводят исследования чаги по нескольким направлениям. Они публикуют работы по водной и спиртовой экстракции чаги с выделением из экстрактов различных компонентов фенольной, терпеновой, белковой природы и полисахаридов. Определяют их структуру, антиоксидантную и антибластомную активность. Их интересы распространяются на поиск способов культивирования чаги [19-29].

Биологический вид гриба Inonotus obliquus (Fr.) Pil (чага)

По ботанической классификации гриб чагу (Chaga) определяют как трутовик косотрубчатый – Inonotus obliquus (Rers.) Pil. sterilis; семейство трутовиковые (Polypаracеae) или гименохетовые (Нymenochaetaceae), тип базидиальные грибы (Basydiomycetes) [30-35]. Это стерильная форма трутового гриба чаги (рис. 1), поскольку его тело образовано бесплодным мицелием. Развитие гриба начинается с момента попадания в поврежденные участки коры дерева рассеянных в воздухе базидиоспор гриба, которые быстро прорастают, образуя мицелий.

Рисунок 1 Трутовый гриб Inonotus obliquus – чага

Нити мицелия (гифы) проникают в древесину, постепенно разрушая её. Одновременно под корой (в местах первоначального проникновения спор) образуется плодовое тело, дающее базидиоспоры. На четвертый год грибница выходит наружу и начинает развиваться бесплодный мицелий, образуя на коре медленно растущие бесформенные черные наросты, которые могут достигать 0,5-1,5 м длины, 10-15 см толщины и массы до 5 кг и более. Именно эти наросты и называют чагой. Гриб постепенно разрушает ствол дерева, который в результате ломается, и дерево гибнет. После этого гриб развивает плодовое тело, представляющее собой плоское образование, состоящее из трубочек, находящихся под слоем коры, при разрушении которой споры высыпаются и разносятся ветром. Цикл развития гриба и образования чаги колеблется в среднем от 1 до 15 лет. [31,32,36]. Ареалы распространения гриба – Россия, Польша, Белоруссия, Северная Америка, Канада [30] а также северо-восточные районы Китая [31]. Чага может расти на березе, реже ольхе, рябине, черемухе, вязе, клене, буке [31,37], но лекарственными свойствами обладает только чага, произрастающая на березе и черной ольхе [36,38].

По системе Фалька, чагу относят к древоразрушающим грибам, вызывающим белую гниль, то есть распад древесины осуществляется по коррозионному типу гниения с одновременным разрушением клетчатки и лигнина [38-42]. Исходными субстратами для этого гриба являются продукты окисления сахаров и сами сахара, а также ароматические соединения, высвобождающиеся при распаде молекулы лигнина [42]. Грибы белой гнили обладают способностью связывать высвобождающиеся лигниновые мономеры в высокополимерные соединения типа гуминовых кислот, а соединения такого рода не свойственны грибам, вызывающим деструктивный распад древесины [42-46]. Бондарцев А.С. по морфологической картине разрушения относит чагу к древоразрушающим грибам с деструктивным типом гниения [47]. Низовской О.П. на основании данных, полученных при культивировании гриба на березовой древесине [39], чага была отнесена к III группе (по Кэмпбеллу [48]), так как для неё характерен одновременный распад лигнина и клетчатки. Некоторые авторы предлагают называть такой тип гнили коррозионно-деструктивным [45, 49,50].

Заготовку чаги ведут в течение всего года, но удобнее её собирать поздней осенью, зимой или ранней весной, когда из-за отсутствия листвы гриб хорошо заметен [38]. Кроме того, в это время содержание в сырье чаги биологически активных веществ достигает максимума [38,36]. Не следует считать, что чага всегда безопасна и может быть использована для лечения и профилактики различных заболеваний. Существуют два главных повода для осторожного отношения к этому грибу. В первую очередь важно установить то, что гриб, который вы нашли на берёзе, действительно чага. Отличительными признаками чаги от сходных видов трутовиков (ложного и настоящего) является её овальная или округлая форма и изрытая, потресканная, с большим количеством мелких бугорков и трещин, поверхность [38]. Кроме того, наросты чаги являются беспорядочным сплетением однородных грибных нитей (мицелия) и в них не обнаруживается дифференциация на ткани [51]. Во-вторых, чага, растущая в экологически не благополучных районах, может накапливать тяжелые металлы, такие, как свинец, мышьяк, стронций [31,52].

Сырье чаги при поступлении на производство и перед поступлением в аптечную сеть обязательно проходит стандартизацию [53]. В нем регламентируется содержание: хромогенного комплекса (меланина) – не менее 10 %, золы общей – не более 14 %, органических примесей (бересты, остатков древесины) – не более 1 %, влажность – не более 14 %. Срок годности для сырья чаги установлен 2 года. Поэтому следует покупать чагу или препараты на её основе, выпускаемые фармацевтической промышленностью, в аптечной сети.

Способы получения лекарственных средств, созданных на основе чаги

Для получения препаратов на основе чаги в пятидесятые годы разработан промышленный способ получения диффузионных соков гриба.

Первой лекарственной формой препарата из чаги становятся водные экстракты, получаемые методом противоточной диффузии и содержащие около 2 % сухого остатка [54]. Водная экстракция измельченного сырья осуществлялась по принципу противотока в диффузионной батарее из 6 диффузоров (продолжительность настаивания в каждом диффузоре – 1 час) при последовательно повышающейся от 45 до 80 ºС температуре (температура головного диффузора 45÷50 ºС и хвостового – 75÷80 ºС). Гидромодуль в установившемся процессе экстракции – 1:2 или 1:2.5. При такой системе экстракции обеспечивалась концентрация соков головного диффузора от 6.5 до 8.5 % в зависимости от качества сырья. На стадии нуч-фильтрования добавляется микроэлемент кобальт в виде водного раствора CoCl2 · 6Н2О или CoSO4 · 7Н2О в количествах, предусмотренных регламентом. Последующее вакуум-уваривание водных извлечений до получения густого экстракта с содержанием 30-32 % сухого вещества протекает при температуре не более 50÷55 ºС и остаточном давлении не выше 70 мм рт. ст. Далее в концентрат, охлажденный до 40 ºС, в целях консервирования добавляют спирт ректификат из расчета 10 % от веса концентрата. После этого концентрат поступает в разливочный аппарат и его фасуют в герметически закрывающиеся толстостенные склянки. Эта форма препарата после всесторонней клинической проверки начинает выпускаться фармацевтическими заводами под названием «Экстракт из березового гриба чаги (густой)». Содержание зольных веществ в препарате 25-29 % [55, 56].

Клинические испытания препарата чаги показали, что вследствие нарушений технологического режима при переработке чаги происходит ухудшение качества препарата и снижается его лечебное действие. Поэтому на протяжении всего процесса необходимо обеспечивать постоянный контроль гидромодуля и температурного режима. Недостаточно строгое соблюдение батарейно-противоточного процесса и, главным образом, температурного режима при экстрагировании чаги, и особенно при вакуумуваривании водных извлечений, приводит к нарушению целостности и агрегативной устойчивости коллоидной системы полифенолоксикарбонового комплекса [57].

С целью получения лекарственных средств со сниженным содержанием зольных элементов созданы лекарственные формы таблетированных препаратов чаги. Они разработаны группой исследователей, возглавляемых П.А. Якимовым. В технологии одного из них полифенолоксикарбоновый комплекс выделяют из традиционно полученных диффузионных соков чаги различными электролитами, а также осаждением его совместно с белками (казеин или альбумин) при соответствующих значениях рН среды [54]. Получение другой формы – «БИН-чага» отличается от традиционной специфической обработкой сырья чаги. Она заключается в вакуум инфильтрации в сырьё воды, охлаждённой до +4 – +6 ºС, настаиванием его при этой температуре. Затем настой удаляют и обработанное таким образом сырьё подвергают противоточной экстракции по традиционной технологии. Полученные диффузионные соки подвергают вакуум-выпариванию [58]. Оба препарата после вакуум высушивания купажировали с наполнителями и затем проводили таблетирование.

Разработан способ, защищённый патентом [7], в котором водное извлечение получают экстракцией чаги водой в две стадии при температуре 60-65 ºС, с использованием ультразвука частотой 20-55кГц, интенсивностью 0,1-2,3Вт/см2. Соотношение сырьё: экстрагент составляет 1:10-15. Экстракт сушат в тонкой плёнке при вакууме 83 мм рт. ст. и температуре 60 ºС. Выход экстрактивных веществ по предлагаемому способу повышается с 62-75 % до 92-95 %.

55кГц, интенсивностью 0,1-2,3Вт/см2. Соотношение сырьё: экстрагент составляет 1:10-15. Экстракт сушат в тонкой плёнке при вакууме 83 мм рт. ст. и температуре 60 ºС. Выход экстрактивных веществ по предлагаемому способу повышается с 62-75 % до 92-95 %.

Разработан способ получения экстракта чаги сухого «Фитопродукт», защищенный патентом [59]. Согласно этому способу сырьё экстрагируют водой в соотношении 1:4-6 в течение 6-12 часов при периодическом перемешивании, затем надосадочную жидкость отделяют, а осадок повторно экстрагируют водой в соотношении 1:3-4 в течение 4-6 часов. Далее экстракты объединяют и высушивают. В препарате регламентируется содержание флавоноидов в пересчёте на кверцетин не менее 15 %.

Проведены клинические испытания разработанных стерильных ампульных препаратов на основе диффузионных соков и полифенолоксикарбонового комплекса, описание которых приведены далее.

В народной медицине существует ряд методов приготовления настоев чаги [37,57,60,61] с получением различной концентрации экстрактивных веществ, что учитывается рекомендуемой дозой их применения.

В 60-х годах на Ленинградском химико-фармацевтическом заводе проведена серия работ по изучению и разработке технологических параметров производственного получения бефунгина [54,57,62-64]. Рекомендовано использовать сырье размером 2÷3 мм для проведения экстрагирования в более мягких температурных условиях без ущерба для выхода экстрактивных веществ, что приводит к улучшению качества препарата. Бефунгин – полугустой экстракт – получают увариванием водных вытяжек чаги до содержания сухих веществ около 20 % с последующим введением в препарат солей кобальта и спирта. По этой технологии измельченную на вальцовой дробилке чагу экстрагируют горячей водой (70 ºС) методом противотока на батарее из трех диффузоров, с продолжительностью настаивания в каждом диффузоре – 1.5 час. К концентрированному извлечению прибавляют расчетное количество кобальта хлористого и упаривают извлечение до готовности при давлении 0.06 МПа и температуре 75±5 ºС, после чего в экстракт вводят расчетное количество спирта этилового (10 %) и фасуют. В соответствии с требованиями ФС, оценка качества бефунгина проводится только по содержанию в нем хромогенного комплекса и кобальта. Содержание хромогенного комплекса в препарате должно быть не менее 6.5 %. В настоящее время бефунгин – это наиболее распространенная лекарственная форма, которую производит фармацевтическая промышленность на основе сырья чаги.

В последнее время производители БАД и косметических средств часто используют в их рецептурах экстракты чаги. Например, в Санкт-петербургской серии пищевых добавок «Драже жизни» выпускают БАД «Драже жизни – коктейль «Тростинка»». Основу препарата составляют: экстракт чаги, лактобактерии, молочная закваска, аминокислоты, микроэлементы, фруктовый пектин. Биологически активные вещества чаги в данном препарате благоприятно сочетаются с лактобактериями «Драже». Данный коктейль рекомендуется больным с онкологическими заболеваниями, язвой желудка и гастритами, также он хорошо подходит для лиц, склонных к аллергии. В продукции серии «Уссурийская тайга» разработана концентрированная основа для производства сиропов «Чага с травами», включающая в себя смесь чаги, шиповника, череды, элеутерококка, мяты. Особое внимание обращает на себя продукция, разработанная в Российском Онкологическом Научном Центре РАМН совместно с Лабораторией натуральных лечебно-профилактических средств. Это фитокапсулы «Чаговит» и «Чаголюкс», в состав которых входит экстракт чаги, полученный по оригинальной технологии. В препарате экстракт чаги сочетается с витаминами С, В1, В2, В6, фолиевой кислотой, что усиливает и дополняет стимулирующие, антиоксидантные, антитоксические, антибластомные и защитные свойства, оптимизирует активность ферментативной системы и метаболизма человека [65,66].

Большой популярностью пользуются кремы в рецептуры, которых включены экстракты чаги, такие как «Чага» (Украина); массажный бальзам Валентина Дикуля (ООО «Фора-Фарм», Москва); бальзам для тела «Лесной лекарь» («ФЛОРА-SI», Балашиха, МО) и ряд других. Они обладают омолаживающим, противоотечным, противовоспалительным, восстанавливающими эффектами, заживляют раны, ожоги и обморожения.

Фармацевтической промышленностью выпускаются спиртовые настойки чаги. Технология их получения заключается в экстракции сырья чаги 70 % спиртом [67]. Проверка препарата на подлинность заключается в определении наличия в нем хромогенного комплекса. Содержание спирта в настойке регламентируется не менее 65 %, сухого остатка – не менее 0,25 %.

Лечебное и физиологическое действие препаратов, созданных на основе чаги и выделенных из неё компонентов

Чем же обусловлен интерес к этому природному объекту? Он объясняется тем, что в народной медицине чагу используют для лечения широкого спектра заболеваний. Настои, отвары, чай из чаги, а также порошок истолченного гриба применяют при желудочно-кишечных заболеваниях, раке, пародонтозе, экземах, дерматитах, псориазе, для лечения ран. Чагу используют как общеукрепляющее средство для повышения общего тонуса организма. По-видимому, особо привлекают исследователей использование чаги в народной медицине для лечения рака. По преданию, от рака губы берёзовым грибом был излечен князь Владимир Мономах. [68-70].

Рассмотрим, какое действие оказывает чага на организм животных и человека. Постараемся ответить на вопрос – Почему она обладает такой разнообразной и высокой биологической активностью, что способна бороться с раком?. Особое внимание необходимо обратить на то, какие препараты на основе чаги подвергались исследованиям. К сожалению, не во всех литературных источниках указывается, каким образом они приготовлены или выделены.

Обширные исследования по физиологической активности различных препаратов на основе чаги проведены в пятидесятые годы прошлого века. Было показано, что токсичность водных экстрактов чаги при пероральном введении белым мышам LD50 составляет 6,5 г/кг веса животного, при подкожном введении LD50 – 0,5 г/кг. Испытывались различные формы препаратов из чаги: жидкий, густой экстракты и порошок. Их токсичность и общее действие изучали на кроликах, кошках и собаках. Индивидуальная переносимость, в зависимости от вида животного к препаратам из чаги, имела существенные различия. Однако, в целом, опыты, поставленные на большом количестве животных, свидетельствовали о том, что эти препараты хорошо ими переносятся.

Токсическое действие препаратов из чаги испытанных на различных видах животных проявлялось у них в виде расстройства движений, а затем паралича. Было установлено, что они действуют угнетающе на центральную нервную систему, а не на периферическую – в области нервно-мышечного синапса, то есть показано их курареподобное действие. Кумулятивные свойства препаратов из чаги исследованы на крысах и кроликах. Крысам ежедневно вводили зондом в желудок препараты чаги в дозе 1 г/кг веса животного в течение пяти месяцев, а кроликам в дозе 0,3 г/кг до шести месяцев. Установлено, что они не обладают кумулятивными свойствами [71], также показано отсутствие у препаратов из чаги пирогенных свойств [72].

Средней лечебной дозой при пероральном применении чаги для человека является 15 мл 2 % раствора три раза в день, что составляет 1 г сухого вещества чаги в сутки (20 мг на 1 кг веса) [1].

Внутривенное и внутримышечное введение препаратов на основе диффузионных соков чаги оказывало более сильное влияние на организм животного. Недостаточная очистка их от балластных веществ, в том числе зольных элементов, приводила к побочным явлениям, таким, как озноб, некроз тканей вокруг места инекционирования, изменения в дыхании и нарушение сердечного ритма [73].

Проведены исследования на животных внутримышечного и внутривенного введения очищенных препаратов из чаги. Для этого были приготовлены образцы из диффузионного сока чаги (при различных способах проведении экстракции) и полифенолоксикарбонового комплекса с различной степенью очистки от балластных примесей и зольных элементов. Наиболее хорошие результаты показали два препарата. Препарат для внутримышечного введения, полученный из диффузионного сока с низкой температурой экстракции (в батарее диффузоров, Т°=30-45 °C), подвергнутый диализу с низкой зольностью 13,5 %, рН=5,4. Другой препарат для внутривенного введения получен на основе полифенолоксикарбонового комплекса, подвергнут диализу с низкой зольностью 12,2 %, рН=7,0. В связи с низкой растворимостью полифенолоксикарбонового комплекса он растворён с использованием хлористого аммония. Первый препарат оказывал благоприятное влияние на сердечную деятельность, повышая сократительную способность миокарда у кролика, кроме того, наблюдался сдвиг дыхания в сторону более спокойного ритма. Второй препарат активировал и восстанавливал жизненные функции нерва, утраченные под влиянием хлористого калия. Авторами сделано заключение о том, что различные способы получения препаратов из чаги видоизменяют их действия на физиологические функции организма животного и функциональные свойства нерва [73].