Доказательная логика
- -
- 100%
- +
Рисунок 19.3. Хук-эффект при очень высокой концентрации аналита
Hook-эффект требует специальной проверки, если методологический принцип изделия делает его возможным. В таких случаях необходимо оценивать высокие концентрации аналита, описывать признаки подозрения на результат вне диапазона и устанавливать действия пользователя: разведение образца, повторное исследование, выдача результата «больше чем» или иные процедуры, предусмотренные изготовителем
Разведение образцов
Если для высоких значений предусмотрено разведение образца, эта процедура должна быть подтверждена. Нельзя автоматически считать, что разведение всегда сохраняет правильность результата. После разведения может измениться матрица, восстановление аналита, фон, интерференция или стабильность. Поэтому необходимо показать, что результат после разведения и пересчета соответствует ожидаемому значению в пределах установленного критерия.
В инструкции должно быть указано, когда требуется разведение, каким растворителем или материалом оно выполняется, какой коэффициент применяется, как пересчитывается результат и в каких пределах такой пересчет допустим. Если разведение подтверждено только для определенного интервала, нельзя распространять его на любые высокие значения.
Аналитический диапазон и клинически значимая область
Аналитический диапазон и клинически значимая область не всегда совпадают. Аналитический диапазон показывает, где изделие способно выдавать надежный результат. Клинически значимая область показывает, где результат влияет на медицинское решение. Иногда клинически значимая область уже аналитического диапазона, и тогда не все измеряемые значения имеют одинаковое значение для решения. Иногда клинически значимая область шире подтвержденного диапазона, и тогда назначение изделия или правила интерпретации должны быть ограничены.
Результат вне диапазона не должен интерпретироваться как обычное количественное значение. Для нижней зоны может требоваться формулировка «ниже предела количественного определения». Для верхней зоны — «выше верхней границы диапазона», разведение или повторное исследование. Такие правила должны быть заранее установлены и отражены в документации.
Типовые проблемы линейности и диапазона
Схема 19.2 — Типовые проблемы линейности и диапазона измерений
— Неподтвержденная нижняя граница диапазона — Как проявляется: Изделие выдает числовые результаты там, где прецизионность недостаточна; Почему это важно: Возникает риск ложной количественной интерпретации низких значений.
— Насыщение сигнала — Как проявляется: При высоких концентрациях результат перестает возрастать пропорционально; Почему это важно: Высокий уровень аналита может быть занижен.
— Hook-эффект — Как проявляется: Очень высокая концентрация аналита дает ложно низкий результат в некоторых иммунологических методах; Почему это важно: Возможна опасная неправильная интерпретация результата.
— Некорректное разведение — Как проявляется: Результат после разведения не соответствует ожидаемому восстановлению; Почему это важно: Пересчитанное значение может быть ошибочным.
— Диапазон не покрывает клинически важные уровни — Как проявляется: Подтвержденный интервал уже, чем область принятия решений; Почему это важно: Назначение изделия становится шире доказанных возможностей.
— Отклонение от линейности около порога — Как проявляется: Результат нестабилен в области клинического решения; Почему это важно: Возможна смена категории результата.
— Использование неподходящей матрицы при проверке — Как проявляется: Линейность подтверждена на модельном материале, не отражающем клинический образец; Почему это важно: Данные могут быть неприменимы к заявленному материалу.
Особенности для полуколичественных и алгоритмических изделий
Для полуколичественных тестов понятие линейности может иметь ограниченное значение, но диапазон категорий и устойчивость переходов между ними остаются важными. Если результат выражается как «низкий», «средний», «высокий» или в виде балльной шкалы, необходимо показать, что категории соответствуют ожидаемому изменению уровня аналита и воспроизводимо отделяются друг от друга. В таких случаях основным вопросом становится не идеальная линейная зависимость, а надежность классификации по уровням и клинический смысл каждой категории.
Для алгоритмических и программных изделий диапазон может относиться не только к концентрации аналита, но и к входным данным. Например, алгоритм может быть проверен на изображениях определенного качества, файлах секвенирования с определенной глубиной покрытия, сигналах в определенных пределах, значениях лабораторных показателей в определенном интервале. Если входные данные выходят за пределы области, на которой алгоритм был разработан и проверен, результат может стать менее надежным. Поэтому для таких изделий необходимо описывать область допустимых входных данных и правила обработки неподходящих или пограничных случаев.
Что правильно и что неправильно при подтверждении линейности и диапазона
Схема 19.3 — Типовые ошибки при подтверждении линейности и диапазона измерений
— Выбор уровней — Правильно: Покрыть весь заявленный диапазон, включая нижнюю и верхнюю границу; Неправильно: Проверить только среднюю часть диапазона.
— Клинические пороги — Правильно: Включить уровни около медицински значимых решений; Неправильно: Не проверять область cut-off или зону принятия решения.
— Материал — Правильно: Использовать заявленную матрицу или обосновать модельный материал; Неправильно: Проверить линейность в буфере и автоматически перенести на клинический материал.
— Разведение — Правильно: Подтвердить восстановление после разведения; Неправильно: Считать разведение автоматически корректным.
— Верхняя граница — Правильно: Проверить насыщение, hook-эффект и правила выдачи результата выше диапазона; Неправильно: Выдавать точные значения выше подтвержденного диапазона.
— Нижняя граница — Правильно: Связать с пределом обнаружения, пределом количественного определения и прецизионностью; Неправильно: Выдавать числа ниже уровня количественной надежности.
— Критерий — Правильно: Оценивать отклонения по уровням и их клинический смысл; Неправильно: Считать высокий достаточным доказательством.
— Полуколичественный результат — Правильно: Проверить устойчивость категорий и переходов между ними; Неправильно: Описать категории без подтверждения их воспроизводимости.
— Алгоритмический результат — Правильно: Описать допустимый диапазон входных данных; Неправильно: Применять алгоритм к данным за пределами проверенной области без дополнительной оценки.
Документирование в отчете
В отчете по подтверждению линейности и диапазона измерений необходимо описать заявленный диапазон, клинически значимые уровни, использованные материалы, способ подготовки образцов, число уровней, число повторов, ожидаемые и измеренные значения, расчет отклонений, графическое представление результатов и критерии приемлемости. Если использовались разведения, необходимо описать схему разведения, матрицу, коэффициенты пересчета и подтверждение восстановления.
Также нужно указать, какие зоны диапазона признаны подтвержденными, а какие требуют ограничения. Если нижняя часть диапазона не обеспечивает количественную надежность, это должно быть отражено в выводе и инструкции. Если верхняя часть требует разведения или выдачи результата «больше чем», это должно быть описано. Если выявлены признаки насыщения сигнала или hook-эффекта, необходимо указать, как они контролируются.
Заявленный диапазон в инструкции и регистрационной документации не должен быть шире подтвержденного. Если фактически подтвержден диапазон от 125 до 1000 копий/мл, нельзя заявлять количественный диапазон от 50 до 1000 копий/мл без дополнительных данных. Если результат ниже нижней границы может быть обнаружен, но не количественно определен, это должно быть ясно указано. Если результат выше верхней границы требует разведения, пользователь должен понимать, когда и как это делать.
Линейность и диапазон измерений, таким образом, являются как техническими характеристиками метода, так и частью доказательной связи между аналитическим результатом и клиническим применением. Они показывают, в каких пределах результат можно считать количественно надежным, где требуется осторожность, где нужно повторное исследование или разведение, а где результат не должен использоваться для заявленного вывода.
Итог главы
Линейность показывает способность аналитической системы давать результаты, пропорциональные содержанию аналита в пределах установленного интервала. Диапазон измерений определяет область, в которой результат изделия может использоваться с подтвержденной правильностью, прецизионностью и пригодностью для заявленного применения. Эти характеристики должны подтверждаться на релевантных материалах, в нескольких уровнях аналита, с заранее установленными критериями приемлемости и с учетом клинически значимых зон. Заявленный диапазон не должен быть шире подтвержденного, а результаты вне диапазона должны иметь четко описанные правила обработки и интерпретации.
Глава 20. Предел обнаружения и предел количественного определения
Предел обнаружения и предел количественного определения относятся к ключевым характеристикам аналитической эффективности медицинских изделий для диагностики in vitro, особенно если изделие должно выявлять низкие уровни аналита или работать в области, близкой к клиническому порогу. Эти характеристики определяют нижнюю границу возможностей изделия: где оно еще не отличает сигнал от фона, где уже способно обнаружить аналит, и где может и обнаружить, и количественно измерить его с приемлемой надежностью.
В практической работе часто смешивают понятия «обнаружить» и «измерить». Для качественного теста может быть достаточно показать, что аналит выявляется (обнаруживается) при низкой концентрации с установленной вероятностью. Для количественного теста этого недостаточно. Если изделие выдает числовое значение (измеряется аналит), нужно показать, что на данном уровне результат имеет приемлемую правильность и прецизионность. Поэтому предел обнаружения и предел количественного определения отвечают на разные вопросы и должны быть подтверждены разными подходами.
Нижняя область аналитической системы обычно описывается через три связанных понятия: предел холостой пробы, предел обнаружения и предел количественного определения. Предел холостой пробы характеризует уровень сигнала, который может быть получен при отсутствии аналита. Предел обнаружения показывает минимальный уровень аналита, который можно надежно отличить от холостой пробы или фонового сигнала. Предел количественного определения показывает минимальный уровень аналита, при котором результат можно количественно оценить с приемлемой точностью и прецизионностью.
Предел холостой пробы — это наибольший ожидаемый результат, который может быть получен для образца без аналита при заданной вероятности ошибки.
Предел обнаружения — это минимальный уровень аналита, который может быть надежно отличен от холостой пробы или фонового сигнала.
Предел количественного определения — это минимальный уровень аналита, при котором результат может быть количественно измерен с заранее установленной приемлемой правильностью и прецизионностью.
Нижняя область аналитической системы
Эти понятия особенно важны для изделий, работающих с низкими концентрациями аналита. Если нижняя граница установлена неправильно, изделие может выдавать ложное ощущение надежности там, где аналитическая система фактически работает нестабильно. Очень низкий уровень сигнала может быть принят за наличие аналита, хотя он не отличается от фона. Или наоборот, аналит может присутствовать, но изделие не обнаруживает его с достаточной вероятностью. Для количественного изделия дополнительный риск состоит в том, что низкое числовое значение может быть воспринято как точный результат, хотя на самом деле вариабельность в этой зоне слишком велика.
Рисунок 20.1. Шкала LoB/LoD/LoQ
Рисунок 20.1 показывает, что предел обнаружения и предел количественного определения не являются одним и тем же. Между LoD и LoQ может существовать зона, где аналит уже обнаруживается, но количественное значение еще недостаточно надежно. Для качественного изделия такая зона может быть приемлемой, если назначение связано только с обнаружением. Для количественного изделия необходимо ясно указать, где начинается область надежной количественной интерпретации.
Предел холостой пробы важен потому, что любой аналитический метод имеет фон. Даже при отсутствии аналита прибор или реакционная система могут давать небольшой сигнал. Этот сигнал может быть связан с шумом прибора, неспецифическим связыванием, фоновым флуоресцентным сигналом, загрязнением, матрицей или другими факторами. Поэтому нельзя считать любой ненулевой сигнал доказательством наличия аналита. Сначала нужно понять, какие значения характерны для холостых образцов.
Предел обнаружения строится уже относительно этого фона. Он должен быть достаточно выше холостой зоны, чтобы вероятность ошибочного обнаружения и вероятность пропуска низкого уровня аналита были приемлемыми. Для разных изделий это может подтверждаться разными способами. В одних случаях используют статистическую оценку распределений холостых и низкоположительных образцов. В других — серии разведений и расчет вероятности обнаружения. В молекулярной диагностике часто оценивают концентрацию, при которой аналит обнаруживается не менее чем в заданной доле повторов, например в 95 % случаев.
Рисунок 20.2. Распределение холостых и низкоположительных образцов
Рисунок 20.2 показывает общую идею: результаты холостых образцов имеют собственный разброс, а низкоположительные образцы дают распределение результатов выше фона. Если эти распределения сильно перекрываются, надежное обнаружение невозможно. Чем лучше отделены низкоположительные результаты от холостых, тем увереннее можно установить предел обнаружения.
Расчетные подходы к пределу холостой пробы и пределу обнаружения
Существуют разные подходы к расчету LoB и LoD. Конкретная методика зависит от типа изделия, распределения данных, количества измерений, вида результата и применимых стандартов или руководств. В учебных целях удобно показать общий статистический подход.
Если результаты холостых образцов приблизительно нормально распределены, предел холостой пробы может быть оценен как:
LoB = x̄_blank + c × SD_blank,
где: — среднее значение результатов холостых образцов; — стандартное отклонение результатов холостых образцов; — коэффициент, выбранный в зависимости от заданной вероятности ошибки.
Для приближенной оценки часто используют коэффициент около 1,645 для одностороннего 95-го процентиля при нормальном распределении:
LoB = x̄_blank + 1,645 × SD_blank.
Предел обнаружения может быть оценен с учетом вариабельности низкоположительных образцов:
LoD = LoB + c × SD_low
где — стандартное отклонение результатов низкоположительных образцов.
При использовании того же коэффициента 1,645 формула может быть записана как:
LoD = LoB + 1,645 × SD_low.
В практической работе важно понимать, что эти формулы являются не «магической процедурой», а способом оценить границу между фоном и низким уровнем аналита. Если данные не соответствуют предпосылкам выбранного метода, распределение резко асимметрично, число наблюдений мало или матрица не соответствует клиническому материалу, расчет может быть методологически слабым.
Пример 20.1 — Условный расчет предела холостой пробы и предела обнаружения
Для оценки нижней области метода исследовали холостые образцы, не содержащие аналит, и низкоположительные образцы с малым содержанием аналита. Получены следующие данные:
• среднее значение холостых образцов: 0,20 Ед/мл;
• стандартное отклонение холостых образцов: 0,05 Ед/мл;
• стандартное отклонение низкоположительных образцов: 0,08 Ед/мл.
Предел холостой пробы:
LoB = 0,20 + 1,645 × 0,05
LoB = 0,20 + 0,082 = 0,282 Ед/мл.
Предел обнаружения:
LoD = 0,282 + 1,645 × 0,08
LoD = 0,282 + 0,132 = 0,414 Ед/мл.
В этом примере результат ниже 0,282 Ед/мл находится в зоне, где он может соответствовать фоновому сигналу. Результат около 0,414 Ед/мл и выше может рассматриваться как уровень, на котором аналит надежно отличается от холостой пробы при заданных условиях оценки. Однако это еще не означает, что начиная с 0,414 Ед/мл результат можно надежно выдавать как количественный. Для этого требуется подтверждение предела количественного определения.
Предел количественного определения
Предел количественного определения имеет особое значение для изделий, выдающих числовой результат. Он показывает, начиная с какого уровня аналит можно измерять с заранее установленной приемлемой правильностью и прецизионностью. Если изделие только обнаруживает наличие аналита, LoQ может не быть центральной характеристикой. Но если результат заявлен как количественный, LoQ становится критически важным.
На практике LoQ устанавливают через оценку низких уровней аналита. Для каждого уровня проводят повторные измерения и оценивают, соответствуют ли результаты критериям правильности и прецизионности. Например, производитель может заранее установить, что на уровне LoQ смещение не должно превышать ±20 %, а коэффициент вариации не должен превышать 20 %. Эти значения приведены только как пример: реальные критерии должны быть обоснованы назначением изделия, клиническим смыслом результата и применимыми требованиями.
Схема 20.1 — Различие LoB, LoD и LoQ
— LoB — На какой вопрос отвечает: Какой сигнал возможен при отсутствии аналита?; Что требуется для подтверждения: Измерения холостых образцов и оценка фонового распределения.
— LoD — На какой вопрос отвечает: Какой минимальный уровень аналита можно надежно обнаружить?; Что требуется для подтверждения: Измерения низкоположительных образцов и отделение от фона.
— LoQ — На какой вопрос отвечает: С какого уровня аналит можно надежно количественно измерять?; Что требуется для подтверждения: Подтверждение правильности и прецизионности на низких уровнях.
Важно не заявлять количественный результат ниже LoQ. Если аналит обнаруживается ниже предела количественного определения, это может быть описано как «обнаружено, ниже диапазона количественного определения» или аналогичной формулировкой, если такая интерпретация предусмотрена назначением изделия. Но выдача точного числового значения ниже LoQ может создать ложное впечатление надежной количественной оценки.
Для LoQ удобно формулировать не одну универсальную расчетную формулу, а условие приемлемости: минимальный уровень может быть принят как предел количественного определения только тогда, когда одновременно выполняются критерии по смещению и прецизионности:
Bias(%) | ≤ Bias_max
CV(%) ≤ CV_max.
Пример 20.2 — Установление LoQ по критериям правильности и прецизионности
Для количественного теста исследованы четыре низких уровня аналита. Критерии приемлемости для LoQ установлены заранее: смещение не более ±20 %, коэффициент вариации не более 20 %.
Схема 20.2 — Пример оценки предела количественного определения
— 0,30 — Смещение, %: -28 %; CV, %: 32 %; Оценка: Неприемлемо.
— 0,50 — Смещение, %: -18 %; CV, %: 24 %; Оценка: Неприемлемо по CV.
— 0,75 — Смещение, %: -12 %; CV, %: 18 %; Оценка: Приемлемо.
— 1,00 — Смещение, %: -8 %; CV, %: 12 %; Оценка: Приемлемо.
В этом примере минимальный уровень, на котором одновременно выполняются критерии по смещению и прецизионности, составляет 0,75 Ед/мл. Следовательно, LoQ может быть установлен как 0,75 Ед/мл при условии, что дизайн исследования, материал и число повторов достаточны для такого вывода.
Корректный вывод должен быть сформулирован ограниченно:
Предел количественного определения подтвержден на уровне 0,75 Ед/мл. На уровнях 0,30 и 0,50 Ед/мл количественная надежность не подтверждена. Результаты ниже 0,75 Ед/мл не должны выдаваться как точные количественные значения без специальных правил интерпретации.
Особенности качественных тестов
Для качественных тестов центральным обычно является предел обнаружения, а не предел количественного определения. Если изделие выдает результат «обнаружено/не обнаружено», задача состоит в том, чтобы показать, при каком уровне аналита положительный результат получается с установленной вероятностью. При этом важно использовать не только один низкоположительный образец, а серию концентраций около предполагаемого предела обнаружения.
Для качественного теста недостаточно показать, что аналит был обнаружен один раз на очень низком уровне. Нужно оценить воспроизводимость обнаружения. Если на концентрации 10 копий/мл результат положительный в 1 из 20 повторов, такой уровень нельзя считать пределом обнаружения. Если на концентрации 50 копий/мл результат положительный в 19 из 20 повторов, такой уровень может быть рассмотрен как кандидатный LoD при условии, что критерий приемлемости установлен заранее.