Доказательная логика
- -
- 100%
- +
В качественных тестах особенно важна зона около LoD. Слабоположительные образцы могут обнаруживаться непостоянно. Это не всегда означает ошибку, но должно быть отражено в характеристиках изделия. Пользователь должен понимать, что результат вблизи предела обнаружения имеет вероятностную природу: чем ниже концентрация аналита, тем выше риск непостоянного обнаружения.
Особенности ПЦР
Для молекулярных тестов, включая ПЦР и другие методы, предел обнаружения часто выражается в копиях на реакцию, копиях на миллилитр, международных единицах на миллилитр или иной единице, соответствующей материалу и назначению изделия. Здесь особенно важно ясно указать, к какому этапу относится значение: к исходному образцу, экстракту, реакции амплификации или пересчитанной концентрации в клиническом материале. При использовании ГСО содержания копий ДНК, разработанных ВНИИМ им. Д.И. Менделеева, необходимо показывать связь аттестованного значения стандартного образца с расчетной концентрацией копий в образце, экстракте или реакционной смеси.
Для молекулярных тестов предел обнаружения часто подтверждают как минимальную концентрацию аналита, обнаруживаемую с заданной вероятностью, например в 95 % повторов. Это связано с тем, что при низких концентрациях молекулы распределяются вероятностно, а отдельная реакция может не получить целевую копию даже при наличии аналита в исходном материале. Поэтому LoD для молекулярного теста имеет вероятностный характер.
Схема 20.3 — Пример подтверждения LoD для качественного NAAT-теста
— 10 — Число повторов: 20; Положительных результатов: 8; Доля обнаружения: 40 %.
— 25 — Число повторов: 20; Положительных результатов: 14; Доля обнаружения: 70 %.
— 50 — Число повторов: 20; Положительных результатов: 19; Доля обнаружения: 95 %.
— 100 — Число повторов: 20; Положительных результатов: 20; Доля обнаружения: 100 %.
В данном примере концентрация 50 копий/мл обнаружена в 19 из 20 повторов, то есть в 95 % случаев. Если заранее установленный критерий состоит в обнаружении не менее 95 % повторов, уровень 50 копий/мл может быть принят как подтвержденный предел обнаружения. Уровни 10 и 25 копий/мл не соответствуют критерию.
Однако такой вывод возможен только при корректном дизайне исследования. Нужно учитывать матрицу, способ подготовки образцов, экстракцию, объем, внесенный в реакцию, число повторов, партии реагентов, приборы, операторов и возможные ингибиторы. Если LoD подтвержден только в буфере, его нельзя автоматически переносить на плазму, мазок, мокроту, кал или другой клинический материал.
Вероятность обнаружения и LoD 95
Для оценки вероятности обнаружения при разных концентрациях может использоваться пробит-анализ или иной подход моделирования зависимости «концентрация — вероятность положительного результата». Такой подход особенно полезен, когда нужно оценить концентрацию, при которой ожидаемая вероятность обнаружения составляет, например, 95 %.
Рисунок 20.3 показывает типичную логику: при очень низкой концентрации аналит обнаруживается непостоянно, а при увеличении концентрации вероятность положительного результата возрастает. LoD95 соответствует уровню, при котором ожидаемая вероятность обнаружения составляет 95 %. В отчете важно указать не только оценку LoD95, но и доверительный интервал, если он рассчитывался, а также диапазон концентраций, на которых построена модель.
Пробит-анализ не должен использоваться как формальная замена хорошего экспериментального дизайна. Если концентрации выбраны неудачно, повторов мало, матрица нерелевантна или результаты нестабильны из-за технических факторов, модель может дать недостоверную оценку. Поэтому статистическая модель должна опираться на корректно спланированное исследование.
Рисунок 20.3. Вероятность обнаружения и LOD95
Материал и матрица при оценке нижней границы
Оценка LoB, LoD и LoQ должна выполняться в материале, соответствующем заявленному назначению изделия. Матрица может существенно влиять на фоновый сигнал, ингибирование реакции, извлечение аналита, неспецифическое связывание и стабильность. Поэтому предел обнаружения, установленный в буфере или искусственной среде, не всегда отражает предел обнаружения в реальном клиническом материале.
Если изделие заявлено для нескольких материалов, например плазмы, сыворотки и цельной крови, необходимо подтвердить нижнюю границу для каждого материала или обосновать перенос данных. Для молекулярных тестов особенно важно учитывать этап экстракции и возможные ингибиторы. Для иммунологических тестов — матричные эффекты, перекрестные реакции и фоновый сигнал. Для сухих пятен крови — гематокрит, объем пятна, условия высушивания и хранения.
Типовые ошибки при подтверждении LoD и LoQ
Схема 20.4 — Типовые ошибки при подтверждении предела обнаружения и предела количественного определения
— Различение LoD и LoQ — Правильно: Отдельно указать уровень обнаружения и уровень надежного количественного измерения; Неправильно: Считать, что обнаружение автоматически означает возможность количественного измерения.
— Выбор материала — Правильно: Использовать заявленную клиническую матрицу или обосновать модельный материал; Неправильно: Подтвердить LoD в буфере и перенести на клинические образцы без обоснования.
— Число повторов — Правильно: Использовать достаточное число повторов около предполагаемого предела; Неправильно: Делать вывод по одному или нескольким единичным обнаружениям.
— Качественный тест — Правильно: Оценивать долю обнаружения на нескольких концентрациях; Неправильно: Указывать самую низкую концентрацию, где был хотя бы один положительный результат.
— Количественный тест — Правильно: Подтвердить правильность и прецизионность на уровне LoQ; Неправильно: Выдавать точные числовые значения ниже уровня количественной надежности.
— NAAT-тест — Правильно: Указать копии/реакцию, копии/мл или другие единицы и способ пересчета; Неправильно: Неясно указывать LoD без связи с объемом образца и этапом реакции.
— Пробит-анализ — Правильно: Использовать корректно выбранные концентрации и достаточные повторы; Неправильно: Строить модель на недостаточных или нерелевантных данных.
— Несколько материалов — Правильно: Подтвердить каждый материал или обосновать сопоставимость; Неправильно: Проверить один материал и заявить все остальные.
— Интерпретация результата — Правильно: Описать правила «ниже LoD», «обнаружено ниже LoQ», «ниже диапазона»; Неправильно: Выдавать пользователю неоднозначные низкие значения.
Эта схема показывает, что нижняя граница метода требует не только расчета, но и правильной интерпретации. Ошибки в этой области особенно опасны, потому что пользователь может придать медицинское значение результату, который аналитически недостаточно надежен.
Документирование в отчете
В отчете по подтверждению предела обнаружения и предела количественного определения необходимо описать назначение изделия, тип результата, материал, используемые образцы, способ приготовления низких концентраций, число уровней, число повторов, партии реагентов, приборы, операторов, условия выполнения и статистический подход. Если использовались холостые образцы, нужно описать их состав и соответствие заявленной матрице. Если использовались низкоположительные образцы, необходимо указать, как установлены их концентрации.
Для LoB нужно представить данные холостых образцов и расчет фоновой границы. Для LoD — данные низкоположительных уровней, расчет или подтверждение вероятности обнаружения. Для LoQ — данные по правильности и прецизионности на низких уровнях и критерии приемлемости. Для NAAT-тестов нужно отдельно указать единицы выражения LoD, объем исходного материала, объем экстракта, объем реакции и способ пересчета, если он используется.
Если предел обнаружения или предел количественного определения подтвержден только для определенного материала, это должно быть отражено. Если для разных материалов получены разные значения, нельзя указывать одно общее значение без обоснования. Если результат ниже LoQ может быть обнаружен, но не должен выдаваться как количественный, это должно быть ясно описано в инструкции и отчете.
Заявления в инструкции должны соответствовать подтвержденным данным. Если LoD подтвержден как 50 копий/мл при 95 % обнаружения, нельзя заявлять надежное обнаружение 10 копий/мл только потому, что на этом уровне были отдельные положительные результаты. Если LoQ подтвержден как 0,75 Ед/мл, нельзя выдавать точные количественные результаты ниже этого уровня без дополнительных данных. Нижняя область метода должна быть описана так, чтобы пользователь понимал границы результата.
Итог главы
Предел холостой пробы, предел обнаружения и предел количественного определения описывают нижнюю область аналитических возможностей медицинского изделия для диагностики in vitro. Предел холостой пробы характеризует фоновый сигнал при отсутствии аналита, предел обнаружения — минимальный уровень, который можно надежно отличить от фона, а предел количественного определения — минимальный уровень, на котором аналит можно количественно измерить с приемлемой правильностью и прецизионностью. Для качественных тестов центральным обычно является надежное обнаружение, для количественных — надежное количественное измерение. Эти характеристики должны подтверждаться в релевантной матрице, с достаточным числом повторов, заранее установленными критериями и ясными правилами интерпретации результатов ниже LoD, около LoD и ниже LoQ.
Глава 21. Аналитическая специфичность и интерференция
Аналитическая специфичность и интерференция относятся к тем характеристикам аналитической эффективности, которые определяют, насколько результат изделия устойчив к влиянию посторонних, близких, сопутствующих или мешающих факторов. Если правильность, прецизионность, линейность и предел обнаружения показывают, насколько надежно изделие получает результат при заданных условиях, то аналитическая специфичность и интерференция отвечают на другой вопрос: не получает ли изделие ошибочный результат из-за того, что реагирует не только на заявленный аналит или потому, что на результат влияет постороннее вещество, состояние матрицы или иной фактор.
Для медицинских изделий для диагностики in vitro это имеет принципиальное значение. Ложноположительный или ложноотрицательный результат может возникнуть не только из-за недостаточной чувствительности или плохой воспроизводимости. Он может быть связан с перекрестной реактивностью, ингибированием реакции, матричным эффектом, лекарственным препаратом, эндогенным веществом, близким микроорганизмом, сходной последовательностью нуклеиновой кислоты, аутоантителами, гемолизом, липемией, высоким уровнем белка, антикоагулянтом, консервантом, качеством изображения или особенностью входных данных алгоритма. Поэтому оценка аналитической специфичности и интерференции должна быть связана с реальными условиями применения изделия.
Аналитическая специфичность — это способность медицинского изделия для диагностики in vitro определять заявленный аналит или объект исследования без значимого влияния со стороны других веществ, организмов, последовательностей, признаков или факторов.
Перекрестная реактивность — это реакция изделия с объектами, сходными с целевым аналитом или мишенью, но не являющимися заявленным объектом определения.
Интерференция — это влияние вещества, компонента матрицы, лекарственного препарата, физиологического состояния, технического фактора или иного условия на результат исследования.
Эти понятия связаны между собой, но не совпадают полностью. Перекрестная реактивность обычно относится к ситуации, когда изделие ошибочно реагирует на другой объект как на целевой аналит. Например, антитело в иммунологическом тесте связывается со структурно сходным белком, а молекулярный тест амплифицирует близкую последовательность другого микроорганизма. Интерференция шире: мешающий фактор может не быть похожим на аналит, но изменять результат. Например, гемолиз может влиять на биохимическое измерение, билирубин — на фотометрический сигнал, гепарин — на амплификацию, а высокая вязкость или клеточность материала — на обработку образца.
Аналитическая специфичность особенно важна для качественных и молекулярных тестов, где результат часто интерпретируется как наличие или отсутствие объекта. Если изделие выявляет заявленную мишень, а также близкий организм, близкую последовательность или сходный антиген, возникает риск ложноположительного результата. Для количественных тестов специфичность также имеет значение: если метод измеряет и заявленный аналит, и метаболиты, фрагменты, родственные молекулы или лекарственные вещества, числовой результат может быть завышен или занижен.
Интерференция может приводить как к ложноположительным, так и к ложноотрицательным результатам. В одном случае мешающий фактор повышает сигнал и создает видимость наличия или более высокого уровня аналита. В другом — подавляет реакцию и приводит к занижению результата или пропуску аналита. В третьем — увеличивает неопределенность и делает результат нестабильным. Поэтому при оценке интерференции важно анализировать как наличие статистического различия, так и клиническое значение изменения результата.
Рисунок 21.1. Интерферент – влияние на систему – изменение результата – клинический риск
Типы влияющих факторов
Потенциальные интерференты и перекрестно реагирующие объекты выбирают исходя из назначения изделия, материала, метода и целевой популяции. Универсального списка, одинакового для всех изделий, не существует. Для биохимического анализа крови важны одни факторы, для молекулярного теста — другие, для иммунологического анализа — третьи, для цифрового алгоритма — четвертые.
Эндогенные интерференты — это вещества или состояния, присутствующие в организме или образце пациента. К ним могут относиться гемоглобин при гемолизе, билирубин при иктеричности, липиды при липемии, высокий уровень белка, ревматоидный фактор, аутоантитела, гетерофильные антитела, эндогенные метаболиты, гормоны, антитела после вакцинации или инфекционного контакта. Их значение зависит от метода: один и тот же фактор может быть критичным для одного изделия и не иметь значения для другого.
Экзогенные интерференты — это вещества, поступающие извне. Это могут быть лекарственные препараты, антикоагулянты, консерванты, компоненты транспортных сред, дезинфицирующие вещества, контрастные препараты, биотин, добавки, вещества из пробирок, реагенты пробоподготовки или загрязнители. Для изделий, применяемых у пациентов, получающих терапию, лекарственные интерференции могут иметь особое значение. Для тестов, используемых в определенной матрице, важны добавки и условия транспортировки.
К биологически близким объектам относятся микроорганизмы, последовательности, антигены, антитела или молекулы, которые могут быть сходны с целевой мишенью. В инфекционной диагностике это близкородственные виды, штаммы, непатогенные представители нормальной микробиоты или организмы, часто присутствующие в том же локусе. В молекулярной диагностике — сходные участки генома, псевдогены, родственные варианты, последовательности других организмов. В иммунологических тестах — структурно близкие белки, фрагменты, изоформы или метаболиты.
Схема 21.1 — Основные типы факторов, влияющих на аналитическую специфичность и интерференцию
— Эндогенные вещества — Примеры: Гемоглобин, билирубин, липиды, белок, метаболиты; Возможное влияние: Изменение сигнала, фон, матричный эффект.
— Иммунологические факторы — Примеры: Гетерофильные антитела, аутоантитела, ревматоидный фактор; Возможное влияние: Ложноположительный или ложноотрицательный результат в иммунологических тестах.
— Экзогенные вещества — Примеры: Лекарства, биотин, антикоагулянты, консерванты, транспортные среды; Возможное влияние: Искажение реакции, подавление сигнала, изменение матрицы.
— Близкие биологические объекты — Примеры: Родственные микроорганизмы, нормальная микробиота, близкие антигены; Возможное влияние: Перекрестная реактивность или ложноположительный результат.
— Сходные последовательности — Примеры: Псевдогены, близкие участки генома, варианты последовательности; Возможное влияние: Неспецифическая амплификация или пропуск мишени.
— Матричные факторы — Примеры: Вязкость, клеточность, pH, соли, ингибиторы, деградация материала; Возможное влияние: Снижение эффективности реакции или нестабильность результата.
— Технические факторы — Примеры: Качество изображения, шум сигнала, артефакты, глубина покрытия; Возможное влияние: Ошибка классификации или вычисляемого результата.
Эта схема не должна использоваться как универсальный обязательный перечень. Она показывает направления анализа. Для каждого изделия нужно определить, какие факторы действительно вероятны и значимы. Например, биотин важен для некоторых иммунологических систем, но не является универсальным интерферентом для всех методов. Гемолиз критичен для ряда биохимических показателей, но может быть незначимым для других. Близкородственные микроорганизмы особенно важны для инфекционных тестов, но их перечень зависит от мишени и материала.
Планирование испытания интерференции и специфичности
Испытание аналитической специфичности и интерференции должно начинаться с анализа риска. Сначала определяют, какие вещества, организмы, последовательности, матричные состояния или технические факторы могут присутствовать в заявленном материале и повлиять на результат. Затем выбирают условия испытания: уровни аналита, концентрации интерферентов, тип матрицы, число повторов, контрольные образцы и критерии приемлемости.
Поскольку экспериментальная проверка всех потенциальных интерферентов физически невозможна, отбор факторов для программы испытаний целесообразно проводить в два шага: сначала оценить вероятность встречаемости фактора именно в заявленной популяции и материале, затем — потенциальную величину его влияния на результат в клинически значимой зоне. Приоритет для экспериментальной проверки отдаётся факторам, сочетающим высокую вероятность встречаемости с высоким потенциальным влиянием.
Для оценки интерференции обычно сравнивают результат образца с потенциальным интерферентом и результат сопоставимого контрольного образца без интерферента. Если изделие количественное, оценивают величину отклонения. Если качественное — оценивают изменение категории результата. Если полуколичественное или алгоритмическое — оценивают переход между категориями, индексами или классами.
Важно проверять интерференцию на уровнях аналита, где влияние может быть клинически значимым. Для качественных тестов это область около предела обнаружения или порога принятия решения. Для количественных тестов — низкий, средний, высокий уровни и области клинических порогов. Для мониторинговых тестов — уровни, где интерференция может имитировать динамику состояния. Если интерференцию проверить только на высоком уровне аналита, можно не заметить влияние, которое приводит к ложному отрицательному результату около порога.
Концентрации интерферентов должны быть обоснованы. Они должны отражать клинически возможные или максимально ожидаемые уровни в заявленной популяции и материале. Если концентрация слишком низкая, испытание не покажет реального риска. Если она чрезмерно высокая и маловероятная, выявленное влияние может быть трудно интерпретировать. В любом случае выбор концентраций должен быть описан в программе испытаний.
Для оценки перекрестной реактивности выбирают объекты, которые могут быть сходны с целевым аналитом или встречаться в том же материале. В инфекционной диагностике это могут быть близкородственные микроорганизмы, возбудители со сходной клиникой или представители нормальной микрофлоры соответствующего локуса. В молекулярных тестах — близкие последовательности, псевдогены, варианты в области праймеров или зондов. В иммунологических тестах — родственные белки, фрагменты, изоформы или антитела к близким антигенам.
Расчет влияния интерферента
Для количественных изделий влияние интерферента часто оценивают через процент отклонения результата образца с интерферентом от результата контрольного образца без интерферента:
Deviation (%) = [(X_test – X_control) / X_control] × 100.
где: X_test — результат образца с потенциальным интерферентом, X_control — результат контрольного образца без интерферента.
Если результат выражается в логарифмических единицах, отношениях, индексах или иных шкалах, подход к расчету должен соответствовать типу результата. Для качественных тестов вместо процента отклонения может оцениваться доля смены категории: например, сколько слабоположительных образцов стали отрицательными при наличии интерферента.
Рисунок 21.2. График влияния интерферента около клинического порога
Пример 21.1 — Оценка влияния интерферента на количественный результат
При оценке интерференции исследовали образец с установленной концентрацией аналита около клинического порога. Контрольный образец без интерферента дал средний результат 100 Ед/мл. Образец с добавлением потенциального интерферента дал средний результат 87 Ед/мл. Заранее установленный критерий приемлемости: отклонение не должно превышать ±10 %.
Расчет:
Deviation (%) = [(87 − 100) / 100] × 100 = −13%.
Отклонение составляет -13 %, что превышает критерий ±10 %. Следовательно, интерферент оказывает значимое отрицательное влияние на результат при данном уровне аналита. Корректный вывод не должен ограничиваться фразой «интерференция выявлена». Нужно указать, при какой концентрации интерферента и на каком уровне аналита выявлено влияние, может ли оно привести к клинически значимому изменению результата и какие ограничения или предупреждения должны быть внесены в документацию.