Доказательная логика

где: Δ_t(%) — изменение результата в момент времени t относительно исходного значения; X_t — результат в момент времени t; X_0 — исходный результат.

Пример 22.1 — Оценка стабильности контрольного материала при хранении

Контрольный материал с исходным значением 100 Ед/мл хранили при 2–8 ° C . Результаты измеряли в начале исследования и через 1, 3, 6 и 12 месяцев. Критерий приемлемости установлен заранее: изменение относительно исходного значения не должно превышать ±10 %.

Схема 22.2 — Пример оценки стабильности контрольного материала

— 0 месяцев — Результат, Ед/мл: 100; Изменение относительно исходного значения: 0 %; Оценка: Исходное значение.

— 1 месяц — Результат, Ед/мл: 98; Изменение относительно исходного значения: -2 %; Оценка: Приемлемо.

— 3 месяца — Результат, Ед/мл: 96; Изменение относительно исходного значения: -4 %; Оценка: Приемлемо.

— 6 месяцев — Результат, Ед/мл: 93; Изменение относительно исходного значения: -7 %; Оценка: Приемлемо.

— 12 месяцев — Результат, Ед/мл: 88; Изменение относительно исходного значения: -12 %; Оценка: Неприемлемо.

Расчет для 6 месяцев:

Δ _ 6(%) = (93 - 100)/(100) × 100 = - 7%.

Изменение составляет -7 %, что находится в пределах критерия ±10 %, поэтому стабильность на сроке 6 месяцев подтверждена.

Расчет для 12 месяцев:

Δ _ 12(%) = (88 - 100)/(100) × 100 = - 12%.

Изменение составляет -12 %, что превышает критерий ±10 %. Следовательно, стабильность на сроке 12 месяцев не подтверждена.

Корректный вывод:

Стабильность контрольного материала при хранении 2–8 °C подтверждена до 6 месяцев включительно. На сроке 12 месяцев выявлено изменение -12 %, превышающее установленный критерий приемлемости ±10 %. Заявление срока стабильности 12 месяцев по данным настоящего исследования не обосновано; требуется дополнительное исследование, изменение срока годности или пересмотр условий хранения.

Этот пример показывает, что срок стабильности нельзя заявлять по последней желаемой точке, если данные ее не подтверждают. Если стабильность подтверждена до 6 месяцев, а на 12 месяцах результат неприемлем, вывод должен быть ограничен

Ускоренная и реальная стабильность

Для подтверждения стабильности могут использоваться исследования в реальном времени и ускоренные исследования. Исследование в реальном времени показывает, как изделие или материал ведет себя при заявленных условиях хранения в течение фактического срока. Это наиболее прямой способ подтверждения срока годности. Ускоренные исследования используют более жесткие условия, например повышенную температуру, чтобы получить предварительную оценку стабильности быстрее.

Ускоренные исследования полезны на этапе разработки или предварительного обоснования, но они не всегда могут полностью заменить данные реального времени. Биологические материалы, белки, нуклеиновые кислоты, антитела, ферменты и сложные реагентные системы могут деградировать не строго предсказуемо. Поэтому, если срок годности изначально обоснован ускоренными данными, в дальнейшем обычно требуется подтверждение в реальном времени. Важно различать два разных предмета ускоренных испытаний. Ускоренное старение по модели, аналогичной ASTM F1980 (Standard Guide for Accelerated Aging of Sterile Barrier Systems for Medical Devices), относится к целостности упаковки и стерильного барьера как физической системы и не является моделью потери аналитической активности реагента. Кинетика потери активности белковых, антительных и ферментных компонентов определяется иными механизмами (термическая денатурация, агрегация) и оценивается методами, изложенными в CLSI EP25; единого стандарта, аналогичного ASTM F1980, для моделирования потери активности сложных биологических реагентов не существует. В отчете нужно четко указать, какие данные являются реальными, какие — ускоренными, и какие ограничения имеет такой подход.

Рисунок 22.2. Реальная и ускоренная стабильность

Стабильность клинического образца и пробоподготовки

Стабильность клинического образца имеет самостоятельное значение. Даже если изделие и реагенты стабильны, аналит может разрушаться, связываться, изменять форму, подвергаться деградации или становиться недоступным для реакции в самом образце. Это особенно важно для РНК-мишеней, белков, клеточных маркеров, метаболитов, нестабильных гормонов, ферментов и материалов, чувствительных к температуре или времени.

Если инструкция допускает хранение образца до исследования, транспортирование, замораживание, размораживание или хранение экстракта, эти условия должны быть подтверждены. Нельзя указывать удобный для пользователя срок хранения без данных. Для качественных тестов необходимо проверять слабоположительные образцы, потому что именно они первыми могут перейти в отрицательную категорию при деградации аналита. Для количественных тестов важно оценивать смещение и изменение результата на клинически значимых уровнях.

Стабильность для качественных, количественных и молекулярных изделий

Для качественных и пороговых тестов стабильность проявляется через сохранение категории результата. Если слабоположительный образец после хранения становится отрицательным, стабильность недостаточна. Если пограничный образец после транспортирования переходит через порог, это может изменить медицинское решение. Поэтому для таких изделий критерий приемлемости может включать и изменение сигнала, и сохранение классификации результата.

Для количественных изделий стабильность обычно оценивают через изменение результата относительно исходного значения или установленного контрольного интервала. Однако процентное изменение само по себе не всегда достаточно. Нужно учитывать, влияет ли это изменение на клиническую интерпретацию. Если результат используется для мониторинга, даже умеренное смещение при хранении может имитировать динамику состояния пациента.

В молекулярных изделиях стабильность связана с сохранностью нуклеиновой кислоты, эффективностью экстракции, ингибированием, условиями транспортировки, замораживанием и оттаиванием, а также хранением экстракта. Для РНК-мишеней стабильность особенно чувствительна к деградации. Для ДНК-мишеней могут быть важны фрагментация, качество материала и условия фиксации, особенно при работе с FFPE-образцами.

Сопоставимость результата при изменении серии, условий или версии

После подтверждения стабильности важно понимать, сохраняется ли аналитический вывод при изменениях, которые неизбежно возникают в жизненном цикле изделия. Это может быть новая серия реагента, новый калибратор, изменение условий транспортирования, использование открытого флакона, обновление программного обеспечения или изменение правил обработки данных. Такие изменения не всегда относятся к стабильности в узком смысле, но они влияют на сохранение аналитической пригодности результата.

Если новая серия реагента дает систематически иной результат, пользователь может ошибочно принять межсерийное различие за изменение состояния пациента. Если обновление алгоритма меняет классификацию, прежние данные об аналитической эффективности могут быть применимы только после оценки сопоставимости версий. Если открытый флакон после нескольких дней использования дает иной уровень сигнала, это должно быть учтено в сроке применения после вскрытия.

Поэтому в документации важно указать, какие изменения контролируются изготовителем и какие данные подтверждают сохранение результата. Для реагентных изделий это может быть межсерийная сопоставимость и стабильность открытого флакона. Для приборных систем — условия калибровки и технического обслуживания. Для программных изделий — управление версиями, оценка влияния обновлений и правила применения прежних данных после изменения алгоритма.

Стабильность программной версии

Для программных и алгоритмических изделий стабильность имеет особую форму. Если на вход подаются одни и те же данные при неизменной версии алгоритма, результат должен быть воспроизводимым в бытовом смысле этого слова, то есть повторная обработка тех же данных не должна произвольно менять итоговый вывод. Если результат меняется из-за обновления программной версии, изменения базы знаний, порогов, правил фильтрации или модели машинного обучения, необходимо оценить сопоставимость версий.

В таких изделиях стабильность результата зависит не от химической деградации, а от управления версиями, входными данными и правилами обработки. Поэтому в отчете нужно фиксировать, какая версия программного обеспечения была использована при аналитической оценке. Если в обращении находится другая версия, необходимо показать, что изменение не влияет на клинически значимый результат или провести дополнительную оценку.

Что правильно и что неправильно при подтверждении стабильности

Схема 22.3 — Типовые ошибки при подтверждении стабильности и сохранения аналитической пригодности

— Срок годности — Правильно: Подтвердить заявленный срок данными в реальном времени или обоснованной программой стабильности; Неправильно: Заявить срок без данных или только по краткому наблюдению.

— Открытый флакон — Правильно: Проверить стабильность после вскрытия при заявленных условиях применения; Неправильно: Считать срок закрытого изделия применимым после открытия.

— Транспортирование — Правильно: Смоделировать заявленные температурные и временные условия; Неправильно: Не оценивать влияние перевозки.

— Клинический образец — Правильно: Подтвердить условия хранения образца до исследования; Неправильно: Указывать срок хранения образца без данных.

— Замораживание/оттаивание — Правильно: Проверить заявленное число циклов; Неправильно: Допускать повторные циклы без подтверждения.

— Пороговые тесты — Правильно: Проверять слабоположительные и пограничные образцы; Неправильно: Использовать только явно положительные образцы.

— Критерии приемлемости — Правильно: Связать критерии с назначением и клинически значимой ошибкой; Неправильно: Оценивать только статистическое изменение без клинического смысла.

— Ускоренная стабильность — Правильно: Отделять предварительное ускоренное обоснование от данных реального времени; Неправильно: Представлять ускоренные данные как полную замену реальной стабильности без обоснования.

— Программная версия — Правильно: Фиксировать версию и оценивать влияние обновлений; Неправильно: Считать изменения ПО технически незначимыми без анализа.

— Вывод — Правильно: Ограничивать вывод проверенными условиями, сроками, материалами и версиями; Неправильно: Распространять вывод на непроверенные условия.

Документирование в отчете

В отчете по стабильности необходимо указать, что именно оценивалось: реагент, набор, калибратор, контрольный материал, клинический образец, экстракт, открытый флакон, транспортные условия или программный результат. Нужно описать условия хранения, температуру, влажность при необходимости, временные точки, число серий, уровни аналита, тип материала, число повторов, критерии приемлемости и результаты по каждой точке.

Если стабильность подтверждается ускоренным исследованием, это должно быть указано отдельно. Необходимо описать модель ускорения, условия воздействия и ограничения вывода. Если данные реального времени еще продолжают накапливаться, это должно быть отражено в плане наблюдения. Нельзя представлять ускоренные данные как полностью эквивалентные реальному сроку без обоснования.

Если стабильность или сопоставимость результата подтверждены только для определенных условий, вывод должен быть ограниченным. Если стабильность подтверждена только при 2–8 °C, нельзя заявлять хранение при комнатной температуре. Если стабильность клинического образца подтверждена только для плазмы, нельзя автоматически переносить вывод на цельную кровь, сухое пятно крови или ликвор. Если версия алгоритма изменилась после испытаний, нужно оценить применимость прежних данных.

В инструкции по применению должны быть отражены подтвержденные условия хранения, транспортирования, срок годности, срок использования после вскрытия, допустимые условия обращения с образцом, правила замораживания и оттаивания, требования к экстракту, ограничения программной версии и действия пользователя при нарушении условий. Выводы отчета и инструкция не должны расходиться.

Итог главы

Стабильность показывает, сохраняет ли медицинское изделие для диагностики in vitro, его реагенты, калибраторы, контрольные материалы, клинические образцы, экстракты или программные результаты аналитическую пригодность во времени и при установленных условиях обращения. Она отличается от прецизионности: повторяемость, внутрилабораторная прецизионность и воспроизводимость относятся к условиям оценки прецизионности и рассмотрены ранее. В настоящей главе стабильность рассматривается как доказательство того, что ранее подтвержденные аналитические характеристики сохраняются в течение срока годности, после транспортирования, после вскрытия, при хранении образца, после замораживания и оттаивания, а также при управляемом изменении серии или версии изделия. Выводы о стабильности должны быть строго ограничены проверенными условиями, сроками, материалами, уровнями аналита и версиями изделия и должны быть согласованы с инструкцией по применению.

Глава 23. Прослеживаемость и калибровка

Прослеживаемость и калибровка являются ключевыми элементами аналитической эффективности медицинских изделий для диагностики in vitro, особенно для количественных измерений. Они позволяют понять, откуда берется числовое значение результата, с чем оно связано и насколько оно сопоставимо с результатами, полученными в другой серии, на другом приборе, в другой лаборатории или в другой системе измерений. Без прослеживаемости и корректной калибровки количественный результат может выглядеть точным, но быть слабо сопоставимым и плохо интерпретируемым.

Для диагностики in vitro это имеет особое значение. Многие результаты используются и как разовая лабораторная информация, и как основание для мониторинга, классификации пациента, оценки динамики, выбора терапии или сравнения с клиническими порогами. Если результат глюкозы, гормона, вирусной нагрузки, белкового маркера, метаболита или лекарственного вещества зависит от произвольной калибровки, меняется между сериями или не связан с признанной системой значений, его клиническая надежность снижается. Пользователь может получить число, но не понимать, насколько оно сопоставимо с клиническим порогом или предыдущим результатом.

Метрологическая прослеживаемость — это свойство результата измерения, при котором результат может быть связан с признанной референтной основой через документированную непрерывную цепь калибровок или сравнений, каждое из которых вносит свой вклад в неопределенность.

Калибровка — это установление зависимости между значениями, приписанными калибраторам, и сигналом аналитической системы, позволяющее получать результат измерения для неизвестных образцов.

Прослеживаемость отвечает на вопрос, к какой системе значений относится результат, калибровка — как аналитическая система переводит сигнал в числовое значение, а неопределенность — насколько надежно это значение выражает измеряемую величину с учетом всех существенных источников вариабельности

Прослеживаемость не следует понимать как формальную ссылку на калибратор. Важно наличие калибратора, а также происхождение значения, которое ему приписано. Значение может быть связано с международным стандартом, референтным материалом, референтной методикой, стандартным образцом, внутренней системой изготовителя или консенсусным значением. Чем яснее и надежнее эта связь, тем сильнее доказательная основа количественного результата. Если происхождение значения не раскрыто, результат может быть трудно сопоставить с результатами других систем.

Калибровка, в свою очередь, не является простой технической процедурой настройки прибора. Она определяет, как сигнал превращается в результат. Если калибровочная зависимость построена некорректно, если калибраторы не охватывают рабочий диапазон, если материал калибратора не ведет себя как клинический образец или если стабильность калибровки не подтверждена, результат пациента может быть смещен. Поэтому калибровка является частью доказательной базы аналитической эффективности.

Для большинства современных белковых и нуклеиновых биомаркеров признанная международная референтная система в настоящее время отсутствует — это типичная, а не исключительная ситуация. Изложенная далее полная цепь прослеживаемости — ориентир, реально достижимый для ограниченного круга давно стандартизированных аналитов; для остальных случаев задача состоит не в достижении полной цепи, а в честном описании системы значений изготовителя и её ограничений.

Метрологическая цепь прослеживаемости

В идеальном случае результат измерения связан с признанной референтной системой. Такая система может включать единицы СИ, первичный референтный материал, референтную методику, референтную лабораторию, вторичные калибраторы, рабочие калибраторы изготовителя и калибраторы, используемые пользователем. В реальной практике для многих аналитов такая полная система отсутствует. Особенно это характерно для сложных биологических маркеров, антител, молекулярных мишеней, клеточных признаков и некоторых алгоритмических результатов. Но даже в этих случаях необходимо описать, к какой системе значений привязан результат и какие ограничения это создает.

Рисунок 23.1. Метрологическая цепь прослеживаемости результата

Рисунок 23.1 показывает, что результат пациента находится в конце цепи, а не существует сам по себе. Если верхние звенья цепи надежны, документированы и применимы к данному аналиту, результат легче интерпретировать и сопоставлять. Если цепь разорвана или не описана, пользователь фактически получает результат, привязанный только к внутренней системе изготовителя. Иногда это допустимо, но должно быть прямо указано, особенно если отсутствует международная референтная система.

Для изделий, результаты которых используются в мониторинге, прослеживаемость особенно важна. Если пациент наблюдается во времени, изменение результата должно отражать изменение состояния, а не изменение калибровочной системы, партии реагента или пересмотра значения калибратора. Для изделий, применяемых в разных лабораториях, прослеживаемость помогает обеспечить сопоставимость результатов между площадками. Для калибраторов и контрольных материалов прослеживаемость является одной из центральных характеристик, потому что они сами используются для переноса значений.

Калибраторы, контрольные материалы, стандартные образцы и референтные материалы

В практике МИ ИВД часто смешивают понятия калибратора, контрольного материала, стандартного образца и референтного материала. Это создает методические ошибки. Калибратор используется для установления зависимости между сигналом и значением. Контрольный материал используется для контроля стабильности работы системы, но обычно не предназначен для калибровки, если это специально не установлено. Стандартный образец или референтный материал имеет установленное значение и неопределенность, а его статус определяется процедурой аттестации и назначением. Термин «референтный материал» относится к международной терминологии; в российском тексте его целесообразно пояснять через понятие стандартного образца.

Схема 23.1 — Различие калибратора, контрольного материала, стандартного образца и референтного материала

— Калибратор — Основное назначение: Установление калибровочной зависимости между сигналом и значением аналита; Что важно для доказательной оценки: Источник приписанного значения, стабильность, диапазон, матрица, прослеживаемость.

— Контрольный материал — Основное назначение: Контроль стабильности и пригодности аналитической системы; Что важно для доказательной оценки: Установленные контрольные пределы, стабильность, матрица, применимость к методу.

— Стандартный образец — Основное назначение: Передача или подтверждение значения с установленными характеристиками; Что важно для доказательной оценки: Аттестованное значение, неопределенность, однородность, стабильность, назначение.

— Референтный материал — Основное назначение: Материал с достаточно однородными и стабильными свойствами для применения в измерительном процессе; Что важно для доказательной оценки: Коммутативность, пригодность к методу, значение и неопределенность при наличии.

— Международный стандарт — Основное назначение: Гармонизация результатов и единиц для определенного аналита или биологической активности; Что важно для доказательной оценки: Связь с международной единицей, область применения, ограничения матрицы.

Контрольный материал нельзя автоматически использовать как калибратор, а калибратор нельзя рассматривать как полноценный референтный материал без подтверждения его статуса. Для каждого объекта нужно понимать, для какой цели он предназначен и какое значение ему приписано.

Калибровочная зависимость

Калибровка строится на серии калибраторов с известными значениями. Аналитическая система измеряет их сигналы, после чего устанавливается зависимость между значением аналита и сигналом. Затем по этой зависимости рассчитываются значения неизвестных образцов. В простейшем случае зависимость может быть линейной:

y = a + bx,

где: x — значение аналита; y — сигнал аналитической системы; a — свободный член; b — наклон калибровочной зависимости.

Однако в МИ ИВД многие методы имеют нелинейную калибровочную зависимость. Это особенно характерно для иммунологических анализов, некоторых ферментативных реакций, флуоресцентных сигналов, хемилюминесцентных методов и широкодиапазонных количественных систем. В таких случаях могут использоваться нелинейные модели, например логистические кривые. В учебном контексте важно не название модели, а принцип: выбранная модель должна адекватно описывать связь между сигналом и значением во всем заявленном диапазоне.